雞NDV F基因與IL-18融合基因核酸菌蛻疫苗的研究.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)所致的一種高度接觸性傳染病，能引起雞、火雞、鴨、鴿子和鸚鵡等多種禽類的感染和死亡，是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的禽病之一。國(guó)際獸疫局將其定為A類疫病，我國(guó)也將其列為一類動(dòng)物疫病。目前，用于防治該病的疫苗主要為弱毒苗和油乳劑滅活苗。弱毒苗價(jià)格低、效果好，但易導(dǎo)致病毒散播；滅活苗安全可靠，但存在免疫期短、成本高、使用較復(fù)雜的缺點(diǎn)

2、。因而具有高特異性、研制簡(jiǎn)單、不散毒等優(yōu)點(diǎn)的核酸疫苗成為了現(xiàn)代疫苗的研究熱點(diǎn)。但研究也發(fā)現(xiàn)核酸疫苗存在免疫原性不強(qiáng)、質(zhì)粒DNA可能整合到宿主DNA上引起病理和毒理反應(yīng)等不足。因此，人們期望從分子佐劑、開(kāi)發(fā)有效的DNA運(yùn)輸載體等方面，提高核酸疫苗的免疫效果和改善其安全性。 本試驗(yàn)將雞新城疫病毒F基因和雞源性白細(xì)胞介素18基因(Chicken Interleukin-18，ChIL-18)構(gòu)建成融合基因F-ChIL-18，并將其克隆

3、到由甲病毒改建的“自殺性”質(zhì)粒上，構(gòu)建成融合表達(dá)F-ChIL-18基因的“自殺性”質(zhì)粒pSFV-F-ChIL-18。然后將該質(zhì)粒與菌蛻結(jié)合，制備成pSFV-F-ChIL-18核酸菌蛻疫苗，以觀察ChIL-18對(duì)NDV F基因核酸菌蛻疫苗是否有免疫增強(qiáng)作用。 1.pSFV-F-Ch IL18核酸疫苗的構(gòu)建 根據(jù)GeneBank公布的雞新城疫病毒(NDV)Lasota株F基因和雞源性白細(xì)胞介素18(ChIL-18)基因序列分

4、別設(shè)計(jì)特異性引物，且在雞NDV F基因引物上游引入BazamH Ⅰ位點(diǎn)、下游引入Sal Ⅰ位點(diǎn)，在ChIL-18基因引物上游引入Sal Ⅰ位點(diǎn)、下游引入Hind Ⅲ、BamH Ⅰ位點(diǎn)。以雞新城疫病毒Lasota株RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增F基因,并將其克隆到pMD18-T中。再擴(kuò)增上游帶有Sal Ⅰ位點(diǎn)、下游帶有Hind Ⅲ、BamH Ⅰ位點(diǎn)的ChIL-18基因，也將其插入到含有F基因的質(zhì)粒pMD18-T-F'中，使兩個(gè)基因首尾相連，

5、且F基因不含終止密碼子，ChIL-18基因不含起始密碼子。最后將融合基因片段定向克隆到pSFV單一啟動(dòng)子(CMV)下游，構(gòu)建成F-ChIL-18融合基因重組“自殺性”質(zhì)粒pSFV-F-ChIL-18。同時(shí)，用上下游均含有BamH Ⅰ位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增NDV F基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物正向插入pSFV質(zhì)粒，構(gòu)建成pSFV-F重組質(zhì)粒。 2.pSFV-F-ChIL18核酸菌蛻疫苗的制備 將含有裂解質(zhì)粒(pHH43)的大腸桿菌DH5a

6、于28℃，200rpm搖床培養(yǎng)，為獲得最大量的菌蛻，當(dāng)OD600=0.4～0.6時(shí)，迅速升高培養(yǎng)溫度至42℃以啟動(dòng)E裂解蛋白的表達(dá)并開(kāi)始計(jì)時(shí)，4小時(shí)后收集菌蛻。菌落計(jì)數(shù)(CFU)結(jié)果表明有99.98％的細(xì)菌被有效裂解。掃描電鏡觀察可見(jiàn)裂解孔道位于細(xì)菌一端或中間，而胞內(nèi)的物質(zhì)己經(jīng)排出，菌蛻保留了較完整的外膜，細(xì)菌形態(tài)沒(méi)有發(fā)生太大改變。 將質(zhì)粒pSFV-F-ChIL-18與pSFV-F重懸于含有菌蛻的的PBS(pH7.4)體系中，加

7、入終濃度25mM CaCl2溶液，37℃，150rpm，30min搖床孵育，制備成核酸菌蛻疫苗。經(jīng)8000rpm，離心10min，分離上清和沉淀。通過(guò)測(cè)定上清液的OD260/280，以確定菌蛻疫苗DNA的量，最終以100ug/羽的量接種雞進(jìn)行免疫試驗(yàn)。 3.新城疫核酸菌蛻疫苗的免疫試驗(yàn) 將150只1日齡非免疫雛雞隨機(jī)分成5組，分別為：pSFV-F-ChIL-18菌蛻疫苗免疫組(Ⅰ組)、pSFV-F-ChIL-18疫苗免疫

8、組(Ⅱ組)、pSFV-F菌蛻疫苗免疫組(Ⅲ組)、新城疫Lasota 株弱毒凍干苗免疫組(Ⅳ組)、空白對(duì)照組(Ⅴ組)。分別于7日齡和21日齡對(duì)Ⅰ組肌肉注射pSFV-F_ChIL-18菌蛻疫苗(100ug/羽)；Ⅱ組肌肉注射pSFV-F-ChIL-18疫苗(100ug/羽)；Ⅲ組肌肉注射pSFV-F菌蛻疫苗(100ug/羽)；Ⅳ組用新城疫Lasota株弱毒凍干苗進(jìn)行點(diǎn)眼與滴鼻(劑量參照說(shuō)明書)、Ⅴ組不做任何處理。通過(guò)間接ELISA及攻毒保護(hù)

9、試驗(yàn)，對(duì)新城疫核酸疫苗的免疫效果進(jìn)行的評(píng)定。間接ELISA測(cè)定免疫雞外周血IL-2、INF-γ含量結(jié)果為：pSFV-F-ChIL-18核酸菌蛻疫苗組與pSFV-F-ChIL-18核酸疫苗組IL-2、INF-γ誘導(dǎo)水平明顯高于pSFV-F核酸菌蛻疫苗組(P<0.01)。試驗(yàn)雞新城疫抗體檢測(cè)結(jié)果為：核酸菌蛻疫苗各組均誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，但免疫原性較弱，抗體水平低，顯著低于新城疫Lasota 株弱毒苗組(P<0.01)。pSFV-