四種雞球蟲DNA疫苗在機(jī)體組織中的分布和在環(huán)境中的釋放.pdf

1、為了對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的四種雞球蟲DNA疫苗:pVAX1.0-TA4-IL-2，pVAX1.0-NA4-IL-2，pVAX1.0-EM8-IL-2，pVAX1.0-LDH-IL-2進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，開(kāi)展了該疫苗的生物安全性試驗(yàn).
　　 按照對(duì)最小使用日齡靶動(dòng)物1次單劑量接種的安全試驗(yàn)要求，將試驗(yàn)動(dòng)物分為疫苗免疫組和非免疫空白對(duì)照組，每羽25μg，于1日齡進(jìn)行腿部肌肉注射免疫1次;按照對(duì)靶動(dòng)物單劑量重復(fù)接種的安全試驗(yàn)要求，將試驗(yàn)動(dòng)物分為

2、疫苗免疫組和非免疫空白對(duì)照組共2組，每羽25μg，分別于7日齡、14日齡、21日齡3次進(jìn)行腿部肌肉注射免疫;按照3批制品對(duì)靶動(dòng)物1次超劑量接種的安全試驗(yàn)要求，將試驗(yàn)動(dòng)物分為第一批疫苗組、第二批疫苗組、第三批疫苗組和空白對(duì)照組共4組，每羽75μg于14日齡進(jìn)行腿部肌肉注射免疫1次;免疫之后每天觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲水、進(jìn)食、糞便、活動(dòng)及死亡情況等，并進(jìn)行詳細(xì)的記錄.于免疫后的1-4個(gè)月內(nèi)分別定期采集雞血液以及心、肝、脾、腎、腸、注射部

3、位肌肉等組織，根據(jù)質(zhì)粒DNA疫苗中基因序列分別設(shè)計(jì)并合成引物，以PCR方法檢測(cè)Kana基因;TA4基因;NA4基因;EM8基因和LDH基因，用來(lái)判斷質(zhì)?；蚱洳糠只蚱卧谏鲜雠K器組織的分布和存留時(shí)間，以及是否整合入動(dòng)物組織細(xì)胞染色體;制備心、肝、脾、腎、腸、注射部位肌肉等組織石蠟切片，觀察質(zhì)粒DNA能否導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生病理?yè)p傷.
　　 按照對(duì)靶動(dòng)物的環(huán)境釋放安全性試驗(yàn)要求，將上述靶實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于免疫前、免疫后1周后每隔2周多點(diǎn)采集受試點(diǎn)

4、周圍水體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞便樣品，以PCR方法檢測(cè)Kana基因;TA4基因;NA4基因;EM8基因和LDH基因，從而判斷質(zhì)粒是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及質(zhì)粒DNA是否經(jīng)機(jī)體主謝產(chǎn)物被排放到外界環(huán)境中.
　　 按照對(duì)其他非靶動(dòng)物的安全性試驗(yàn)要求，采用試驗(yàn)動(dòng)物為3周齡ICR小鼠，每只25μg，于30日齡進(jìn)行腿部肌肉注射免疫一次.于免疫后的1-3個(gè)月內(nèi)分別定期采集小鼠血液以及心、肝、脾、腎、注射部位肌肉組織，按照上述PCR方法判斷質(zhì)粒在非靶動(dòng)物臟器組

5、織內(nèi)的分布和存留時(shí)間，以及是否整合入其細(xì)胞染色體;制備石蠟切片觀察質(zhì)粒DNA能否能引起非靶動(dòng)物的病理?yè)p傷.
　　 結(jié)果顯示，受試動(dòng)物未出現(xiàn)任何異常臨床生理反應(yīng);DNA疫苗攜帶的五種基因均未轉(zhuǎn)化入腸道茵群;質(zhì)粒DNA也沒(méi)有被排放到外界環(huán)境中;在血液、心、肝、脾、腎和注射部位均能檢測(cè)到質(zhì)粒DNA或其主要元件，并分別能存留約于免疫后的2個(gè)月左右，免疫后3個(gè)月之后就不能檢測(cè)出質(zhì)粒DNA或其主要元件;質(zhì)粒DNA未與染色體DNA發(fā)生整合;上