高效甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及細(xì)胞周期基因的花粉特異表達(dá)分析.pdf

1、該研究以甘藍(lán)型冬性和半冬性油菜為主要材料,研究了影響冬性和半冬性油菜子葉外植體芽再生和遺傳轉(zhuǎn)化的因素;利用優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系,將擬南芥的細(xì)胞周期基因?qū)氪河筒薟estar中,研究了細(xì)胞周期基因?qū)τ筒嘶ǚ郯l(fā)育和形態(tài)發(fā)生的影響;此外,建立了一種利用超聲波分離油菜、小麥等花粉細(xì)胞核的新方法,借助流式細(xì)胞儀對(duì)野生型和轉(zhuǎn)細(xì)胞周期基因的油菜花粉細(xì)胞核進(jìn)行了DNA含量分析.獲得的主要結(jié)果如下:1、通過對(duì)培養(yǎng)基、激素配比、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、蔗糖濃度等影響油菜

2、子葉外植體芽再生因素的優(yōu)化篩選,建立了適合于冬性和半冬性油菜子葉的優(yōu)化再生體系.將子葉在附加1mg/L BA和1mg/L 2,4-D的MSB5培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3天,再轉(zhuǎn)入含有4.5mg/L BA的MMO培養(yǎng)基中培養(yǎng),可顯著增加芽再生率,并且可將再生周期比對(duì)照縮短1/3.在這一條件下10個(gè)冬性和半冬性油菜品種的平均再生率達(dá)80.82﹪,其中9個(gè)品種的芽再生率均在75﹪以上,最高可達(dá)98.89﹪.2、在業(yè)已建立的高效快速再生體系的基礎(chǔ)上,通過

3、優(yōu)化預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間,采用合適的選擇壓,建立了適用于冬性和半冬性油菜的子葉高效快速遺傳轉(zhuǎn)化體系.利用這一體系對(duì)8個(gè)品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化測試,結(jié)果遺傳轉(zhuǎn)化效率均在12.09﹪以上,最高的可以達(dá)到28.29﹪.PCR和DNA雜交分析證明了轉(zhuǎn)基因的整合及拷貝數(shù)的分布.同時(shí),通過對(duì)預(yù)培養(yǎng)基的激素配比、MES、對(duì)無菌幼苗進(jìn)行4℃低溫處理等因素進(jìn)行優(yōu)化,降低了下胚軸褐化率,從而初步建立了適合于冬性和半冬性油菜下胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化體系.3、通過對(duì)超聲波處理

4、時(shí)間、分離花粉培養(yǎng)基等因素的研究,利用超聲波破碎花粉壁法,成功地分離到比較純的油菜單核、二核和三核期花粉細(xì)胞核.這些核可用于流式細(xì)胞儀DNA含量分析和高純度的核DNA制備.利用此法,分離的花粉細(xì)胞核,并用流式細(xì)胞儀測定了兩個(gè)物種不同時(shí)期的花粉細(xì)胞核的DNA含量.首次探測到油菜成熟花粉群體中存在2n花粉核.4、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將花藥特異啟動(dòng)子控制下的細(xì)胞周期基因?qū)氪河筒薟estar中.并對(duì)周期蛋白基因CycD2轉(zhuǎn)基因后代的