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1、青島大學(xué)碩士學(xué)位論文嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株堿性磷酸酶基因的克隆與表達(dá)姓名:楊麗申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專(zhuān)業(yè):臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師:閆志勇20100603CloneandprokaryoticexpressionofStenotrophomonasmaltophiliaD2alkalinephosphataseAbstract0bjectiveWeobtainedaproteinhyperproducingStenotrophomonasma
2、ltophiliastrainfromthedigestivetractofPerinereisaibuhitensisGrubeAftertheproteinpurified,wesequenceditsaminoacidinOrdertogetthecodingsequencebybioinformaticsandMolecularBiologytechnologyWealsoexpressedthecodingsequencein
3、BL21toknowmoreaboutthesecretionandexpressionmechanismoftheD2MethodsThepurifiedD2alkalinephosphatasewasdigestedbyenzymes,andthensequencedbyESI—MS/MSWeblastedthosesixaminoacidfragments,andfoundthatthosefragmentshadhighiden
4、titiesofthestenotrophomonasmaltophiliaK279aandR55l3ThephosphatasegenewasamplifiedbythemethodofPCRwiththeprimerdesignedaccordingtotheK279aandl巧513whohadhigherIdentitiesThenweconjunctedthePCRproducttoTvectorandsequencedWea
5、lsoexpressedthegenewhichverificationbysequencinginEscherichiacoliBL21(DE3)byyieldinghybridplasmidpET32a,inducedwith口TG,andidentifytheres/dtbyWesternBlotWealsousedthe48hzymogenicsupematanttodetectthealkalinephosphataseact
6、ivity。ResultsWegota1438bpgenesequenceofthestenotrophomonasmaltophiliaD2,thephosphatasegenecontainedasingleORFspanning1233bp,anditsGeneBanknumberwasGQ413951WetranslatedtheORFint0aminoacidsequence,andcompareditwiththesteno
7、trophomonasmaltophiliaK279aandR5513alkalinephosphataseTheiridentitieswere685%and736%WealsocomparedthephosphataseaminoacidsequencewiththeaminoacidfragmentswhichsequencedbyESI—MS/MS,theidentitieswere100%,100%,632%,778%,889
8、%and421%TheORFencodeda66KDproteinWesternBlotindicatedthattherecombinantproteinistheD2alkalineproteaseWealsofoundthesequenceofthefirst20aminoacidinthephosphataseaminoacidactedassignalpeptide,whichmayplayanimportantroleint
9、heproteinIsecretionThe48hzymogenicsupematanthadalkalinephosphataseactivity,theactivitieswas1879ConclusionwegainedthegeneofD2alkalinephosphatase,andsuccessf;ulexpresseditinEscherichiacolineproteinhadphosphataseactivity,it
10、mightbeanewsourceofphosphataseofmarinemicroorganisms,andanewexpressionsystemPostgraduate:YANGLi(ClinicalLaboratoryDiagnostics)AdvisedbyProfYANZhiYongKeywords:StenotrophomonasMaltophilia;AlkalinePhosphatase;Clone;expressi
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