嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的吡蟲啉羥基化酶的研究.pdf

1、本文主要研究了嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia CGMCC 1.1788,R551-3和K279a菌株間羥基化煙堿類殺蟲劑吡蟲啉（Imidcloprid，IMI）的機(jī)制差異；從S. Maltophilia R551-3菌株中克隆和表達(dá)了8個(gè)單加氧酶基因，其中黃素單加氧酶Smal2279 蛋白具有IMI 羥基化活性。
　　 S.maltophilia CGMCC 1.1788，R551-3和

2、K279a 均具有羥基化IMI的能力，其中S.Maltophilia CGMCC1.1788的羥基化能力明顯高于R551-3和K279a。細(xì)胞色素P450 酶抑制劑胡椒基丁醚（PBO）抑制S. Maltophilia CGMCC1.1788的IMI 羥基化活性,但不抑制R551-3和K279a的IMI 羥基化活性；黃素單加氧酶抑制劑甲硫咪唑(methimazole)均抑制三個(gè)菌株的IMI 羥基化活性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在S. malto

3、philiaCGMCC1.1788 中存在細(xì)胞色素P450和黃素單加氧酶催化的兩種IMI 羥基化機(jī)制。R551-3和K279a 蛋白組分析表明，K279a菌株中沒有細(xì)胞色素P450 酶，其催化IMI 羥基化只有黃素單加氧酶參與。
　　 上述結(jié)果也解釋了S. Maltophilia CGMCC 1.1788 具有比其他兩個(gè)菌株高得多的IMI 羥基化能力的原因。
　　 S. Maltophilia 羥基化IMI所需的氧來自于

4、空氣中的氧分子，因而IMI 羥基化酶為單加氧酶類，從S. Maltophilia R551-3的全基因組中共檢索到16個(gè)單加氧酶，從R551-3菌株中克隆單加氧酶基因，并在E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行異源表達(dá)，HPLC 分析測(cè)定酶活性。結(jié)果表明8個(gè)成功表達(dá)的單加氧酶中，只有含orf2279 表達(dá)蛋白的E. Cloi BL21（DE3）具有IMI 轉(zhuǎn)化能力。液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析顯示，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分子量為271（M+H），與5-h

5、ydroxy IMI的分子量一致，說明orf2279 蛋白具有IMI的羥基化功能。
　　 Orf2279的生物信息學(xué)分析表明，orf2279 蛋白屬于黃素單加氧酶類中的烷醛單加氧酶(Alkanal monooxygenase，也稱之luciferase)。與其同源性最高的是Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032的luciferase-like monooxygenase，同源性為46％。