柑橘果實(shí)特異基因CsPMEI啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化番茄的研究.pdf

1、果實(shí)特異啟動(dòng)子對(duì)于利用植物基因工程改良果實(shí)品質(zhì)性狀至關(guān)重要。分離柑橘果實(shí)特異性啟動(dòng)子并分析其功能對(duì)研究柑橘果實(shí)成熟的分子機(jī)制以及利用生物技術(shù)提高果實(shí)品質(zhì)均有重要的意義。目前還尚未有分離獲得柑橘果實(shí)特異啟動(dòng)子的報(bào)道,本研究在前期利用Genome Walking技術(shù)分離了柑橘果實(shí)特異基因CsPMEI的5’上游1137bp啟動(dòng)子區(qū)域及構(gòu)建了分別包含三個(gè)不同啟動(dòng)子功能區(qū)域驅(qū)動(dòng)intron-GUS的雙元表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,建立了適于Micro-To

2、m番茄的GUS組織化學(xué)染色體系,利用瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)初步分析了不同啟動(dòng)子區(qū)域驅(qū)動(dòng) GUS基因在番茄各組織器官中的表達(dá)調(diào)控,通過優(yōu)化Micro-Tom番茄潮霉素遺傳轉(zhuǎn)化體系,并成功獲得轉(zhuǎn)化待測(cè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因番茄植株,通過 GUS染色進(jìn)一步鑒定該啟動(dòng)子的功能。主要研究結(jié)果概括如下:
　　(1)GUS染色體系的建立
　　為消除Micro-Tom番茄各組織器官本身內(nèi)源GUS活性對(duì)GUS染色結(jié)果的干擾,本研究通過篩選不同pH值的磷酸緩沖液

3、處理外植體,確定最適緩沖液pH為7.2。
　　(2)瞬時(shí)表達(dá)初步分析目標(biāo)啟動(dòng)子功能
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)法將不同目標(biāo)啟動(dòng)子區(qū)域驅(qū)動(dòng) GUS基因轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄的各組織器官,初步分析不同啟動(dòng)子區(qū)域的表達(dá)調(diào)控。根據(jù)染色結(jié)果初步判斷,CsPMEI啟動(dòng)子-334~-1137區(qū)域具有果實(shí)特異性調(diào)控功能,這一結(jié)果有待于通過穩(wěn)定表達(dá)分析進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　(3)優(yōu)化Micro-Tom番茄抗潮霉素的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

4、>　　通過篩選潮霉素濃度,試優(yōu)化了Micro-Tom番茄抗潮霉素的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以苗齡10d的 Micro-Tom番茄子葉和下胚軸為外植體,農(nóng)桿菌侵染濃度為0.1(OD600),浸染時(shí)間為15min,共培養(yǎng)36h后外植體轉(zhuǎn)移至潮霉素濃度為10mg.L-1的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選,最終獲得18株抗性植株,轉(zhuǎn)化率為10.8％。
　　(4)穩(wěn)定表達(dá)鑒定目標(biāo)啟動(dòng)子功能
　　利用PCR技術(shù)對(duì)抗性植株進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果18株抗性植株均有目的條帶擴(kuò)