蠟梅熱激蛋白CpHSP1基因啟動(dòng)子的克隆與功能初探.pdf

1、熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs)是生物有機(jī)體(或離體細(xì)胞)在受到脅迫因子,如:高溫、低溫、干旱、ABA、重金屬等應(yīng)激原的刺激后誘導(dǎo)合成或含量增加的一類應(yīng)激蛋白質(zhì)。根據(jù)分子量的大小可分為:HSP100s、HSP90s、HSP70s、HSP60s、smHSPs(small HSPs)五大類。每類熱激蛋白都在植物體內(nèi)普遍存在,其中smHSPs是最為常見的一類,它能被高溫、低溫、高鹽、干旱、激素以及機(jī)械損傷等多種脅迫

2、因子誘導(dǎo),同時(shí)也能受到種子的萌發(fā)過程、花藥發(fā)育過程及果實(shí)的成熟過程等調(diào)控。smHSPs主要是充當(dāng)著分子伴侶的功能,它不依賴ATP就能阻止變性蛋白的積累、保護(hù)蛋白的折疊,在植物抵抗并適應(yīng)脅迫環(huán)境與生長(zhǎng)發(fā)育的方面起著重要作用。
　　 蠟梅素有耐寒、耐旱和耐剪的“三耐”與凍不壞、旱不死和不缺枝“三不”的美譽(yù)。HSPs作為重要的逆境響應(yīng)蛋白,在蠟梅高效逆境防御機(jī)制中扮演怎樣的角色、發(fā)揮什么作用是一個(gè)值得探討的問題。我們的研究團(tuán)隊(duì)克隆了蠟

3、梅熱激蛋白基因CpHSP1,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)具有較強(qiáng)的脅迫響應(yīng)特征和組織特異性。為了進(jìn)一步探索CpHSP1基因參與蠟梅逆境響應(yīng)和發(fā)育過程的機(jī)理,本論文運(yùn)用hiTAIL-PCR技術(shù)從蠟梅基因組DNA中獲得CpHSP1基因的啟動(dòng)子,并對(duì)該啟動(dòng)子的功能進(jìn)行初步分析。主要取得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.蠟梅CpHSP1基因啟動(dòng)子克隆
　　 在已獲得蠟梅熱激蛋白CpHSP1基因序列的基礎(chǔ)上,利用hiTAlL-PCR技術(shù)對(duì)蠟梅CpHSP1

4、基因上游未知啟動(dòng)子序列進(jìn)行了擴(kuò)增,最終獲得954bp的啟動(dòng)子片段。
　　 2.蠟梅CpHSP1基因啟動(dòng)子元件分析
　　 運(yùn)用PlantCar在線分析軟件對(duì)該啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,該啟動(dòng)子具有TATA-box和CAAT-box等基本轉(zhuǎn)錄元件,以及與脫落酸(ABA)應(yīng)答有關(guān)的ABRE元件、與光和厭氧生活及ABA的應(yīng)答相關(guān)的G-BOX元件、熱應(yīng)答元件HSE、與干旱相關(guān)MBS元件、激活特定分生組織的順式作用元件OCT、與花特異表達(dá)

5、有關(guān)的元件G-BOX以及胚乳表達(dá)必須的順式調(diào)控元件Skn-1_motif。此外,該啟動(dòng)子還具有光效應(yīng)元件CATT-motif、晝夜節(jié)律順式調(diào)控有關(guān)的順式調(diào)控元件circadian等元件。
　　 3.植物表達(dá)載體構(gòu)建
　　 利用酶切、連接等技術(shù)手段將CpHSP1基因啟動(dòng)子替換表達(dá)載體pCAMBIA-1300-221中的CaMV35S組成型啟動(dòng)子序列,與GUS報(bào)告基因連接,通過PCR和雙酶切驗(yàn)證說明植物表達(dá)載體pCAMBIA