河套蜜瓜高效再生和轉(zhuǎn)化體系建立及Rs-AFP2（R39）基因的導(dǎo)入.pdf

1、河套蜜瓜是內(nèi)蒙古西部地區(qū)的名優(yōu)特產(chǎn),目前正在進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā),但每年因病害的嚴(yán)重發(fā)生而造成重大損失.傳統(tǒng)的噴施農(nóng)藥和常規(guī)育種技術(shù),均未能解決這一嚴(yán)重的問題.隨著生物技術(shù)的發(fā)展,植物抗病基因工程手段給河套蜜瓜抗病育種帶來了新的契機(jī).Rs-AFP2(Raphanus Sativus L. antifungal-protein2是從蘿卜種子中分離到的一種抗真菌蛋白.它分子量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、生物能耗低、抗菌譜較寬、抗菌活性很強(qiáng),且不易使病原菌產(chǎn)生抗

2、性;它是植物防御體系中重要的組成部分.在國外Rs-AFP2基因已經(jīng)被克隆并導(dǎo)入煙草等植物,表達(dá)了很高的抗真菌活性.當(dāng)將Rs-AFP2的V39換成R39后,Rs-AFP2(R39)的抗真菌活性還可進(jìn)一步提高.該研究對Rs-AFP2基因進(jìn)行改造設(shè)計(jì),進(jìn)而合成了Rs-AFP2(R39)基因序列.在此基礎(chǔ)上建立了以pC18為克隆載體、pBin438為植物表達(dá)載體、根癌農(nóng)桿菌LBA4404為介導(dǎo)載體的河套蜜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系.同時(shí)建立了河套蜜瓜高效再

3、生組織培養(yǎng)體系.進(jìn)而將Rs-AFP2(R39)基因?qū)牒犹酌酃匣蚪M,獲得了抗白粉病能力有所提高的轉(zhuǎn)基因植株.河套蜜瓜高效再生體系研究部分.通過直接不定芽發(fā)生途徑建立高效再生體系.試驗(yàn)對組織培養(yǎng)主要影響因子進(jìn)行研究和優(yōu)化,結(jié)果如下:子葉外植體最佳日齡為4日齡;外植體最佳取樣部位為子葉近軸端1/3切段;接種方式為子葉切塊遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基;再生芽分化培養(yǎng)基為MS附加6-BA0.9mg/L;再生芽伸長培養(yǎng)基為MS附加6-BA0.3mg/L;再

4、生芽生根培養(yǎng)基為MS附加IAA1.5mg/L.以此優(yōu)化體系對河套蜜瓜進(jìn)行再生培養(yǎng),外植體再生率達(dá)到85﹪以上,單個(gè)外植體萌發(fā)伸長芽數(shù)達(dá)到8個(gè)以上,再生芽生根成苗率達(dá)到95﹪以上.形態(tài)學(xué)和組織解剖學(xué)觀察結(jié)果表明,該研究獲得的再生芽屬于直接發(fā)生型;子葉外植體上再生芽發(fā)生部位具有明顯的極性現(xiàn)象;這種極性現(xiàn)象的發(fā)生與子葉內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的不對稱性和維管束對營養(yǎng)的極性運(yùn)輸有關(guān).該研究還成功誘導(dǎo)出直接發(fā)生和間接發(fā)生兩種類型的體細(xì)胞胚,進(jìn)而獲得了再生植株.

5、對體胚再生培養(yǎng)的幾個(gè)關(guān)鍵影響因子的研究結(jié)果如下:體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS附加2,4-D2.0mg/L+6-BA1.0mg/L為最佳濃度配比.體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)期內(nèi),先進(jìn)行2周黑暗培養(yǎng)再進(jìn)行1周見光培養(yǎng)效果較好.培養(yǎng)基糖源濃度以60g/L較適合體細(xì)胞胚的發(fā)生和發(fā)育.解剖學(xué)觀察結(jié)果表明,該研究獲得的體細(xì)胞胚為單細(xì)胞起源,分化進(jìn)程與合子胚相似.但不同外植體、同一外植體不同部位體細(xì)胞胚分化進(jìn)程存在著明顯的不一致性.目的基因合成和載體構(gòu)建部分.參照Rs-A

6、FP2 cDNA序列和前人經(jīng)驗(yàn),設(shè)計(jì)改造Rs-AFP2基因;以PCR擴(kuò)增二次延伸法合成了Rs-AFP2(R39)基因全序列,并將該基因片段插入到pUC18之上,構(gòu)建了pUAFP2(R39)克隆載體.然后通過二次連接法將Rs-AFP2(R39)基因片段與pBin438連接環(huán)化.構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體pBinAFP2(R39).最后再通過三親雜交方法,將pBinAFP2(R39)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入介導(dǎo)載體根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株之中.河套蜜瓜遺傳

7、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選鑒定部分.用攜帶有pBinAFP2(R39)質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化河套蜜瓜,試驗(yàn)對幾個(gè)影響轉(zhuǎn)化的重要因素進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果如下:轉(zhuǎn)化受體子葉的最佳日齡為4日,最佳共培養(yǎng)時(shí)間為4日,轉(zhuǎn)化子篩選培養(yǎng)基Kan適合濃度為75mg/L.該研究獲得一批Kanr植株,經(jīng)PCR檢測,有兩株為陽性.對一株的特征譜帶進(jìn)行回收測序,結(jié)果表明,Rs-AFP2(R39)基因已經(jīng)整合到河套蜜瓜的基因組中.進(jìn)一步在溫室內(nèi)進(jìn)行白粉病抗性鑒定,