大巖桐遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與LEA蛋白基因的導(dǎo)入.pdf

1、大巖桐(Sinningia Speciosa)原產(chǎn)于巴西，是極為雅致的溫室內(nèi)觀賞花卉，但在栽培過程中喜歡溫濕環(huán)境也不耐旱．胚胎發(fā)生后期富集蛋白(LEA)出現(xiàn)在胚發(fā)育后期．在干旱、高鹽或低溫脅迫下，LEA基因在各種植物的營養(yǎng)器官也被誘導(dǎo)．LEA蛋白具有高度的親水性，使植物能夠在水分虧缺時，保護(hù)膜系統(tǒng)及生物大分子免受破壞．本實(shí)驗(yàn)測定大巖桐水分脅迫的生理生化指標(biāo)以確定其耐早性，試圖采用基因工程的方法，初步建立大巖桐的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并將LEA蛋

2、白基因?qū)?，以獲得耐早性的大巖桐品種．實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.大巖桐水分脅迫生理生化指標(biāo)的測定本研究利用5％、15％、25％、35％的聚乙二醇(PEG-6000)人工模擬干旱條件從生理的角度對大巖桐的抗旱性進(jìn)行了研究，測定了葉綠素含量、膜透性等幾個生理生化指標(biāo)。結(jié)果表明，不同PEG濃度處理下，葉綠素含量隨著PEG濃度的增大而降低；丙二醛(MDA)隨PEG濃度增大而增大；膜透性隨著PEG增加而呈上升趨勢；POD活性則呈先升后降趨勢．

3、 2.建立了以葉片為外植體的高頻再生體系取大巖桐植株幼嫩葉片接種在MS2(MS+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA)中分化培養(yǎng)，獲得了83.3％的再生頻率。 3.以葉盤法建立了大巖桐的遺傳轉(zhuǎn)化體系用葉盤法確定大巖桐的轉(zhuǎn)化條件為：將葉片切成1x1cm2在MS2(MS+1.0mg/LBA+0.1mg/L NAA)中預(yù)培養(yǎng)2d．將二次活化至OD600=0.5左右的菌液離心，重懸于相同體積的液體AAM培養(yǎng)基中，將預(yù)培養(yǎng)葉片放

4、入其中，侵染10min,滅菌濾紙吸干，放入MS2中暗培養(yǎng)4d．然后將葉片在含500mg/L Cef的液體MS培養(yǎng)基中振蕩脫菌1h左右，無菌水沖洗4-5次后用無菌濾紙吸取多余水分，轉(zhuǎn)入MS2+250mg/L Cef中進(jìn)行延遲篩選培養(yǎng)6d，再轉(zhuǎn)入MS2+50mg/LKm+250mg/L Cef中篩選培養(yǎng)，再生芽轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基MS5(1/2MS+10mg/LKm+250mg/L Cef)中進(jìn)行生根篩選培養(yǎng)。 4.轉(zhuǎn)基因植株的鑒定在