PRRS病毒ORF2～5基因的原核表達(dá)及重組蛋白的純化.pdf

1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文PRRS病毒F2～5基因的原核表達(dá)及重組蛋白的純化姓名：谷紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：楊漢春2002.5.1!里查些查蘭墮主蘭堡堡奎一一一中文摘要本研究利用RT—PCR技術(shù)擴(kuò)增和克隆了猹鐾建董啞呸堡盒延瘟垂(PRRSV)BJ4株的ORF2～4基因，對(duì)ORF2～5基因核苷酸序列和編碼產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行比較分析屙，通過PCR方法得到缺失N一端疏水序列的基因片段dORF2～5(deletingORF

2、2～5)。分別構(gòu)建了表達(dá)PRRS病毒BJ4株GP2、GP3、GP4和GP5蛋白的原核重組表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒在太題拄營(yíng)中的誘導(dǎo)表達(dá)及重組蛋白的純化進(jìn)行了研究。r／1利用RTPCR技術(shù)成功地?cái)U(kuò)增和克隆了PRRS病毒BJ4株的基因ORF2～4，運(yùn)用一相關(guān)分子生物學(xué)分析軟件分析了ORF2～5編碼蛋白的信號(hào)肽、糖基化位點(diǎn)、穿膜區(qū)、疏水性和抗原表位等分子特征：ORF2編碼256個(gè)氨基酸殘基，分子量為295KO：含有2個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)，1個(gè)

3、跨膜區(qū)(215238位氨基酸殘基)，5個(gè)主要抗原表位：等電點(diǎn)為1033；信號(hào)肽位于139位氨基酸殘基；編碼產(chǎn)物的N端和C末端都為疏水區(qū)。ORF3編碼254個(gè)氨基酸殘基，分子量為29KD；含有7個(gè)潛在的N一糖基化位點(diǎn)，1個(gè)跨膜區(qū)(4～28位氨基酸殘基)，6個(gè)主要抗原表位：等電點(diǎn)為788：信號(hào)肽位于1～22位氨基酸殘基，與跨膜區(qū)部分重合：編碼產(chǎn)物的N端為一強(qiáng)疏水區(qū)C末端為兩親性。ORF4編碼178個(gè)氨基酸殘基，分子量為195KD；含有4個(gè)潛

4、在的N一糖基化位點(diǎn)，3個(gè)跨膜區(qū)(第1～23、113～132、161～179位氨基酸殘基)，6個(gè)主要抗原表位；等電點(diǎn)為782；信號(hào)肽位于1～21位氨基酸殘基，在第一個(gè)跨膜區(qū)內(nèi)；編碼產(chǎn)物的N端和C端都為強(qiáng)硫水區(qū)。ORF6編碼201個(gè)氨基酸殘基，分子量為222KD；含有4個(gè)潛在的N一糖基化位點(diǎn)，3個(gè)跨膜區(qū)(9～31、66～83、106～129位氨基酸殘基)，6個(gè)主要抗原表位；等電點(diǎn)為801：信號(hào)肽位于1～25位氨基酸殘基，與跨膜區(qū)部分重合；編

5、碼產(chǎn)物含有一個(gè)疏水的N一端和三個(gè)疏水的中間區(qū)域，而C末端為親水序列。2利用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pGEMORF23、pGEMORF3、pGEM—ORF4和pGEMORF5擴(kuò)增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF2、dORF3、dORF4和dORF5。將缺失基因片段分別克隆至原核表達(dá)載體pGEX4T2中，成功構(gòu)建了能高效表達(dá)PRRS病毒融合型重組蛋白GSTdORF2、GST_dORF3、GSTdORF4和GSTdORF5的基因一l：樣重組