Enterobacter cloacae Z0206富硒多糖對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、本課題組前期從自然界分離、篩選并馴化得到一株高產(chǎn)胞外多糖細(xì)菌菌株Enterobacter cloacae Z0206，該菌株不僅多糖產(chǎn)量高，而且對(duì)硒有較強(qiáng)的耐受能力，在含有無(wú)機(jī)硒的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)可以將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為硒多糖(Se-ECZ-EPS)，Se-ECZ-EPS含硒量為535.7mg/kg。初步生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)，Se-ECZ-EPS可以提高小鼠的細(xì)胞和體液免疫功能，改善環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫抑制，在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)Se-ECZ-EPS對(duì)

2、H2O2引起的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的氧化損傷具有保護(hù)作用。
　　本研究擬在前期研究Se-ECZ-EPS可以改善小鼠免疫功能的基礎(chǔ)上，探討Se-ECZ-EPS在動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)中的免疫調(diào)節(jié)作用，為將其開(kāi)發(fā)成潛在的動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)制劑奠定基礎(chǔ)。本研究設(shè)計(jì)了四個(gè)試驗(yàn):試驗(yàn)一，首先采用小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)進(jìn)行了Se-ECZ-EPS在動(dòng)物中使用的的安全性評(píng)價(jià)。試驗(yàn)二，在確定了Se-ECZ-EPS在動(dòng)物上的使用安全性后，為了拓展其在水產(chǎn)及畜禽

3、養(yǎng)殖動(dòng)物上的應(yīng)用，選擇水產(chǎn)甲殼類(lèi)的理想模式動(dòng)物-螯蝦為試驗(yàn)對(duì)象，研究了Se-ECZ-EPS對(duì)螯蝦的免疫調(diào)節(jié)功能及對(duì)感染白斑病毒后的保護(hù)作用;試驗(yàn)三，在水產(chǎn)豐豐螯蝦研究基礎(chǔ)上深入探討了Se-ECZ-EPS對(duì)家禽動(dòng)物-肉仔雞的促生長(zhǎng)及免疫調(diào)節(jié)作用;試驗(yàn)四，進(jìn)一步選擇斷奶仔豬為試驗(yàn)對(duì)象，深入研究了Se-ECZ-EPS對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、免疫功能、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性的影響并探討其生物學(xué)機(jī)制;通過(guò)以上研究為Se-ECZ-EPS在動(dòng)物中

4、的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)一、Z0206富硒多糖的安全性評(píng)價(jià)
　　為了奠定Z0206富硒多糖在水產(chǎn)及畜禽養(yǎng)殖動(dòng)物上應(yīng)用的基礎(chǔ)，本研究首先采用小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)驗(yàn)證其在動(dòng)物上的使用安全性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)雌、雄兩性別最大耐受量均大于20.0g/kg體重，依據(jù)GB15193.4-2003《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法-急性毒性試驗(yàn)》表明Se-ECZ-EPS無(wú)毒，為其在水產(chǎn)動(dòng)物、畜禽動(dòng)物上的

5、應(yīng)用提供了可能性。
　　試驗(yàn)二、Z0206富硒多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物螯蝦免疫功能的影響
　　在確定Se-ECZ-EPS在動(dòng)物上的使用安全性基礎(chǔ)上，以水產(chǎn)甲殼類(lèi)的理想模式動(dòng)物-克氏原螯蝦(Procambarus clarkii(Girard))為動(dòng)物模型，通過(guò)注射1μg g-1 Se-ECZ-EPS，測(cè)定免疫相關(guān)指標(biāo)和基因表達(dá)，同時(shí)探討Se-ECZ-EPS對(duì)螯蝦感染自斑病毒后的保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示，在注射Se-ECZ-EPS24，4

6、8和72h后，螯蝦血液中酚氧化酶(PO)，呼吸爆發(fā)(RB)和超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著升高(P＜0.05);基因表達(dá)結(jié)果顯示，在注射Se-ECZ-EPS24和48h后，絲氨酸蛋白酶、HSP70和Mn-SOD基因表達(dá)顯著上調(diào)，而酚氧化酶在24到72h后無(wú)顯著影響;14天的攻毒試驗(yàn)表明，注射Se-ECZ-EPS后能夠顯著提高螯蝦感染W(wǎng)SSV后的存活率（對(duì)照組:0％、Se-ECZ-EPS組:59.7％）。綜上結(jié)果揭示，Se-ECZ-EP

7、S可以提高克氏原螯蝦的免疫功能，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。
　　試驗(yàn)三、Z0206富硒多糖對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、免疫功能及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
　　在研究了Se-ECZ-EPS對(duì)螯蝦的免疫調(diào)節(jié)功能及感染白斑病毒后的保護(hù)作用基礎(chǔ)上，繼而深入探討Se-ECZ-EPS在家禽養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位的另一種動(dòng)物-肉仔雞上的促生長(zhǎng)及免疫調(diào)節(jié)作用。
　　3.1.Z0206富硒多糖對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、胴體品質(zhì)的影響
　　試驗(yàn)選取1日齡艾維茵

8、肉仔雞240羽，隨機(jī)分為5個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12羽。對(duì)照組在基礎(chǔ)日糧中以亞硒酸鈉的形式添加0.15 mg/kg的硒水平，四個(gè)試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中分別添加280、560、840、1120 mg/kg的Z0206Se-ECZ-EPS（四個(gè)試驗(yàn)組硒含量分別為0.15、0.30、0.45、0.60 mg/kg）。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，添加840、1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS可以顯著提高肉仔雞0-6周平均日增重，顯著

9、降低料重比(P＜0.05);添加560 mg/kg、840 mg/kg、1120 mg/kg Se-ECZ-EPS則顯著降低了胸肌、腿肌的滴水損失(P＜0.05)，而對(duì)肌肉pH無(wú)顯著性影響。結(jié)果表明Se-ECZ-EPS可以降低雞肉的滴水損失，有效提高肉仔雞的生長(zhǎng)性能。
　　3.2.E.cloacae Z0206富硒多糖對(duì)肉仔雞免疫功能的影響
　　肉仔雞免疫功能研究結(jié)果顯示:血清抗氧化指標(biāo)方面:與對(duì)照組和280 mg/kgSe

10、-ECZ-EPS組相比，添加840mg/kg和1120mg/kg的Se-ECZ-EPS可顯著增加抗氧化酶GSH-Px、SOD的活性，顯著降低MDA的含量(P＜0.05)。細(xì)胞因子含量方面:添加280mg/kg、560mg/kg、840 mg/kg和1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS均能顯著提高血清TNF-α和IL-2的濃度（P＜0.05），同時(shí)，560mg/kg和1120 mg/kgSe-ECZ-EPS組血清IL-6的水平亦顯著

11、提高(P＜0.05)?？贵w水平方面:添加840mg/kg和1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS顯著提高了21、35日齡血清新城疫HI水平（P＜0.05），而在42日齡，只有840 mg/kg組新城疫HI水平顯著升高(P＜0.05);此外，添加1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS能顯著提高免后7d、14d血清禽流感抗體水平（P＜0.05）。提示Se-ECZ-EPS可以通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性、促進(jìn)血清細(xì)胞因子分泌、提高血清抗體水平

12、來(lái)增強(qiáng)免疫功能，進(jìn)而提高肉仔雞的生長(zhǎng)性能。
　　3.3.E.cloacae Z0206富硒多糖對(duì)肉仔雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
　　肉仔雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)研究結(jié)果顯示:添加560 mg/kg和840 mg/kg的Se-ECZ-EPS顯著降低了十二指腸隱窩深度，顯著提高了十二指腸絨毛高度和隱窩深度比VCR(P＜0.05)，而添加1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS顯著提高了空腸絨毛高度（P＜0.05）。提示Se-ECZ-EPS改善

13、了肉仔雞腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)，有利于養(yǎng)分物質(zhì)的吸收，進(jìn)而提高肉仔雞的生長(zhǎng)性能。
　　試驗(yàn)四、Z0206富硒多耱?qū)嗄套胸i生長(zhǎng)性能、免疫功能、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性的影響
　　在研究Se-ECZ-EPS對(duì)肉仔雞促生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫功能、改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位的斷奶仔豬為試驗(yàn)對(duì)象，探討Se-ECZ-EPS對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、免疫功能、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性的影響及其作用機(jī)制。

14、　　4.1.Z0206富硒多糖對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響
　　試驗(yàn)選擇150頭28日齡“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機(jī)分成5組:對(duì)照組（基礎(chǔ)日糧）、Na2SeO3組（基礎(chǔ)日糧+0.30 mg/kg Na2SeO3）、Na2SeO3+APS組（基礎(chǔ)日糧+0.30 mg/kg Na2SeO3+560 mg/kg黃芪多糖）、Na2SeO3+EPS組（基礎(chǔ)日糧+0.30 mg/kg Na2SeO3+560 mg/kg Z0206多糖）、

15、Se-ECZ-EPS組（基礎(chǔ)日糧+560 mg/kg Z0206富硒多糖）。結(jié)果顯示，日糧中添加Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS、Se-ECZ-EPS顯著提高斷奶仔豬平均日增重(P＜0.05)，且Se-ECZ-EPS組顯著高于Na2SeO3組(P＜0.05)，而與Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS組無(wú)顯著性差異;Na2SeO3+EPS、Se-ECZ-EPS組料重比顯著低于對(duì)照組和Na2SeO3組(P＜0.05)

16、，與Na2SeO3+EPS組無(wú)顯著性差異。結(jié)果提示:Se-ECZ-EPS可以促進(jìn)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，使用效果與黃芪多糖APS相當(dāng)。
　　4.2.Z0206富硒多糖對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響
　　斷奶仔豬免疫功能結(jié)果顯示，在抗氧化功能方面:與對(duì)照組相比，日糧中添加Na2SeO3+EPS、Se-ECZ-EPS顯著提高仔豬血清總抗氧化力(T-AOC)(P＜0.05)、顯著降低了血清丙二醛(MDA)含量(P＜0.05)。此外，Se-E

17、CZ-EPS組血清谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著提高了(P＜0.05)，而與Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS組相比沒(méi)有顯著性差異。細(xì)胞因子方面:日糧中添加Na2SeO3+EPS、Se-ECZ-EPSS顯著提高了仔豬血清TNF-α、IL-2、IL-6含量(P＜0.05)，而與Na2SeO3+APS組相比沒(méi)有顯著性差異。免疫球蛋白方面:相比于對(duì)照組和Na2SeO3組，日糧中添加Se-ECZ-E

18、PS顯著提高了仔豬血清IgG、IgM含量，且Se-ECZ-EPS組IgM含量顯著高于Na2SeO3+APS組(P＜0.05)。組織抗菌肽表達(dá)方面:Na2SeO3+APS組、Na2SeO3+EPS組、Se-ECZ-EPS組顯著提高了肝臟抗菌肽基因PR-39、Hepcidin的表達(dá)(P＜0.05);且Se-ECZ-EPS顯著提高了十二指腸中pBD-1的基因表達(dá)，提高了空腸和回腸中pBD-2的基因表達(dá)(P＜0.05);而Na2SeO3+EPS

19、提高了空腸和回腸中pBD-2的基因表達(dá)（P＜0.05），Na2SeO3+APS只提高了回腸中pBD-2的基因表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)果提示:Se-ECZ-EPS可以通過(guò)提高血清免疫球蛋白含量、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌、提高肝臟和腸道抗菌肽基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)免疫功能。
　　4.3.Z0206富硒多糖對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性的影響
　　斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性研究結(jié)果顯示:斷奶仔豬日糧中添加Na2SeO3+EP

20、S、Se-ECZ-EPS顯著提高了十二指腸、空腸絨毛高度和隱窩深度比VCR(P＜0.05)，明顯增加空腸絨毛高度(P＜0.05)。腸道微生物多樣性分析顯示，Se-ECZ-EPS可以提高結(jié)腸、盲腸內(nèi)容物中微生物多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)），與Na2SeO3組相比，添加Se-ECZ-EPS能夠增加結(jié)腸、盲腸中革蘭氏陽(yáng)性菌（厚壁菌門(mén)）比例，減少革蘭氏陰性菌（擬桿菌門(mén)）比例。結(jié)果提示:Z0206富硒多糖可以改善腸道結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)菌群平衡，進(jìn)而提