青霉素菌渣堆肥工藝及青霉素抗性基因的分布影響研究.pdf

1、中國(guó)是抗生素的生產(chǎn)和使用大國(guó)，以青霉素為例，其生產(chǎn)和使用量在國(guó)內(nèi)始終居于首位。青霉素生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生大量的菌渣，因其富含高蛋白，具有資源化回收或利用的可能，但菌渣中含有一定量的青霉素及其代謝產(chǎn)物，若處置不當(dāng)，易引發(fā)抗生素抗性菌及抗性基因的誘導(dǎo)和富集，對(duì)環(huán)境和人類健康造成潛在威脅。本研究采用高溫好氧堆肥工藝，將青霉素菌渣與豬糞混合堆肥處理，以期消除菌渣中的青霉素殘留，實(shí)現(xiàn)菌渣的“變廢為寶”，同時(shí)探討青霉素菌渣堆肥過(guò)程中β-內(nèi)酰胺酶基因型菌群

2、的誘導(dǎo)富集效應(yīng)，評(píng)價(jià)青霉素菌渣堆肥化處置的安全性。
　　本研究以豬糞和青霉素菌渣為原料，以碎木屑為調(diào)節(jié)劑進(jìn)行為期30d的高溫好氧堆肥，整個(gè)堆制過(guò)程在江蘇省南京市蔬菜科技園完成。堆肥過(guò)程中設(shè)置4個(gè)處理:處理1，豬糞∶青霉素菌渣=1∶1;處理2，豬糞∶青霉素菌渣=2∶1;處理3，豬糞∶青霉素菌渣=4∶1;對(duì)照組，純豬糞。通過(guò)檢測(cè)堆體的物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)比分析不同青霉素菌渣添加比例對(duì)堆肥腐熟度的影響;基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(R

3、eal-time PCR)研究方法，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶A（bla-TEM、bla-CTX-M-1、bla-CTX-M-9）、B(bla-IMP-1、bla-VIM-2、bla-NDM-1)、C(bla-CMY)、D(bla-OXA-23)四類基因進(jìn)行絕對(duì)定量，初步探討青霉素菌渣堆肥過(guò)程中β-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的演變過(guò)程;篩選青霉素降解菌，分析其降解特性，評(píng)價(jià)其成為青霉素菌渣堆肥菌劑的可行性。主要研究結(jié)論如下:
　　經(jīng)過(guò)30d的堆制過(guò)程

4、，4個(gè)處理組物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)指標(biāo)均顯示堆肥已腐熟，對(duì)比處理組和對(duì)照組堆肥理化參數(shù)發(fā)現(xiàn)，添加青霉素菌渣有助于延長(zhǎng)堆肥的高溫期。堆肥結(jié)束后，各處理的堆體溫度接近室溫，堆料顏色變?yōu)樯詈稚?，堆體體積減小并變得松散，開(kāi)始出現(xiàn)土腥味;pH值分別為7.3、7.4、7.3和7.9，EC值分別為6.3、5.5、5.3和4.3ms/cm;有機(jī)碳含量分別下降了14.1％、19.7％、17.7％和27.1％，總氮含量分別下降了27.4％、14.0％、4.4

5、％和16.5％;發(fā)芽指數(shù)(GI)均超過(guò)80％，均達(dá)到了堆肥無(wú)植物毒性標(biāo)準(zhǔn)。
　　高溫好氧堆肥方式可以有效降解青霉素菌渣中的青霉素殘留。運(yùn)用超高效液相色譜(UPLC)法測(cè)定處理1、2、3的青霉素殘留濃度，分別由初始的（305.1±16.8）mg/kg、（208.6±4.2）mg/kg和（74.9±3.0）mg/kg降至濃度低于UPLC方法檢測(cè)限。各個(gè)處理的青霉素降解均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，處理1青霉素鈉的降解速率常數(shù)（k）為0.3

6、d-1，降解半衰期(t1/2)為1.9d;處理2青霉素鈉的k為0.2d-1，t1/2為2.4d;處理3青霉素鈉的k為0.2d-1，t1/2為2.3d，與常溫(25℃)下青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的降解半衰期(39.4d)相比，堆肥化處理大大縮短了青霉素的降解時(shí)間。
　　高溫好氧堆肥過(guò)程對(duì)不同處理組的β-內(nèi)酰胺酶不同基因型數(shù)量都有一定消減作用。堆肥結(jié)束(30d)后，4個(gè)處理中bla-TEM基因數(shù)量與初始(0d)相比分別減少了69.4％、53.3％

7、、67.9％和51.7％;bla-CTX-M-1基因數(shù)量與初始相比分別減少了93.4％、98.8％、98.9％和84.6％;bla-CTX-M-9基因數(shù)量與初始相比分別減少了99.0％、99.9％、99.9％和99.7％。bla-IMP-1基因數(shù)量在處理1和處理2堆制結(jié)束分別增加至初始值的21.8和16.3倍，而處理3和對(duì)照組中bla-IMP-1基因數(shù)量與初始相比分別減少了99.8％和72.6％。處理1和處理3中bla-VIM-2基因數(shù)

8、量在堆肥結(jié)束后有所上升，分別增加為原來(lái)的0.7和4.0倍，處理2和對(duì)照組分別減少了99.8％和78.3％。bla-CMY基因數(shù)量在處理1、2、3堆制過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，至堆肥結(jié)束分別減少了80.5％、43.6％和88.3％。堆肥結(jié)束后，處理1和處理2中已檢測(cè)不到bla-OXA-23基因，而處理3和對(duì)照組中該基因數(shù)量與初始相比分別減少了80.2％和74.3％。整個(gè)堆肥期間，各個(gè)處理樣品中均未檢測(cè)到bla-NDM-1基因。
　　通過(guò)平板

9、劃線法從處理組篩選出一株青霉素高效降解新菌，命名PC-2T，已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC1.15283)。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，菌株P(guān)C-2T屬螯合球菌屬（Chelatococcus sp.）。經(jīng)形態(tài)學(xué)及革蘭氏染色觀察，菌株P(guān)C-2T是革蘭氏陰性菌，在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形，乳白色，表面光滑，中間有凸起，不透明，邊緣整齊，直徑約為1～2mm。在掃描電子顯微鏡下觀察為短桿狀，寬約為0.8～1.0μm，長(zhǎng)約為1.8～2

10、.8μm。主要脂肪酸為C18∶1 w7c(50.7％)和C19∶0 cyclo w8c(22.3％)。經(jīng)HPLC法測(cè)得的G+C mol％含量為70.9mol％。當(dāng)葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、接種量為14％、pH為6～8時(shí)，菌株P(guān)C-2T在37℃下振蕩培養(yǎng)6h，對(duì)底物濃度為400mg/L的青霉素鈉的降解率達(dá)98％以上。
　　青霉素菌渣堆肥產(chǎn)品各理化指標(biāo)及生物學(xué)指標(biāo)已達(dá)腐熟標(biāo)準(zhǔn)，能夠用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。高溫好氧堆肥過(guò)程對(duì)典型的幾類β-內(nèi)酰胺