禾谷鐮刀菌隨機(jī)插入突變體的構(gòu)建及其水楊酸代謝途徑關(guān)鍵基因鑒定.pdf

1、赤霉病是小麥的重要病害之一，其主要致病菌是禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum Schwabe）。目前禾谷鐮刀菌誘發(fā)赤霉病的機(jī)理尚不清楚。對(duì)禾谷鐮刀菌的功能基因進(jìn)行研究，有助于科學(xué)認(rèn)識(shí)禾谷鐮刀菌的致病機(jī)理，為赤霉病的防治奠定分子基礎(chǔ)。為此本文主要做了以下研究:
　　1.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建禾谷鐮刀菌的T-DNA隨機(jī)插入突變體。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，每轉(zhuǎn)化106個(gè)分生孢子得到70-80個(gè)T-DNA隨機(jī)插入

2、突變體。經(jīng)分離純化，得到了365個(gè)潮霉素抗性為陽(yáng)性的突變單株。在SNA培養(yǎng)基上鑒定突變單株的生長(zhǎng)狀況，在含水楊酸的SNA培養(yǎng)基上鑒定其生長(zhǎng)狀況，在溫室接種小麥鑒定其致病力。結(jié)果得到6株突變體在普通SNA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢;8株在普通SNA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)產(chǎn)生的色素減少;3株對(duì)水楊酸敏感，在含2.0 mM水楊酸的SNA培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng);2株在溫室接種小麥后致病力明顯下降。其中，△Ma334在普通SNA培養(yǎng)基上同時(shí)表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢和菌落白化，△Ma

3、208同時(shí)表現(xiàn)為在普通SNA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢和在含2.0 mM水楊酸的SNA培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)，△Ma39則同時(shí)表現(xiàn)為在普通SNA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢和接種小麥后致病力明顯下降。
　　對(duì)以上16株突變體基因組進(jìn)行PCR，結(jié)果表明這16株突變體單株均含有潮霉素抗性基因(HPH)序列。以T-DNA右翼序列設(shè)計(jì)的3個(gè)嵌套引物和2個(gè)簡(jiǎn)并引物對(duì)這些突變體基因組進(jìn)行巢氏PCR(TAIL-PCR)，對(duì)擴(kuò)增得到DNA片段進(jìn)行克隆測(cè)序。得到4個(gè)突變體的T

4、-DNA側(cè)翼序列。將這些側(cè)翼序列與禾谷鐮刀菌的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，獲得了如下信息:
　　T-DNA在△Ma39的插入位點(diǎn)位于禾谷鐮刀菌supercontig3.4的542464 bp處，位于基因FGSG_06605.3的中間。該基因可能編碼β-葡萄糖苷酶的前體蛋白，與葡萄糖的分解相關(guān)。T-DNA的插入可能使基因FGSG_06605.3無(wú)法正常表達(dá)，導(dǎo)致△Ma39在普通SNA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，及接種小麥麥穗后致病力明顯下降。

5、　　T-DNA在△Ma247的插入位點(diǎn)位于禾谷鐮刀菌supercontig3.6的1547302 bp處，位于基因FGSG_13581.3的中間。該基因編碼一個(gè)未知蛋白，T-DNA的插入可能使基因FGSG_13581.3無(wú)法正常表達(dá)，導(dǎo)致△Ma247在普通SNA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)菌落白化。
　　T-DNA在△Ma256的插入位點(diǎn)位于禾谷鐮刀菌supercontig3.3的2133337 bp處，位于FGSG12730.3上游819bp

6、處和FGSG_05397.3上游1339 bp處。這兩個(gè)基因編碼的均為未知蛋白。T-DNA的插入可能使FGSG_12730.3和FGSG_05397.3無(wú)法正常表達(dá)，導(dǎo)致△Ma256在普通SNA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)菌落白化。
　　T-DNA在△Ma319的插入位點(diǎn)位于禾谷鐮刀菌supercontig3.6的1360744 bp處，位于基因FGSG_09387.3的下游。根據(jù)Blastx的結(jié)果，該插入位點(diǎn)位于一個(gè)非典型蛋白中間，可能使該蛋

7、白不能正常表達(dá)，從而導(dǎo)致△Ma319在普通SNA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢。
　　2.以葡萄糖為唯一碳源的改良SNA培養(yǎng)基為對(duì)照，以水楊酸為唯一碳源的改良SNA培養(yǎng)基培養(yǎng)禾谷鐮刀菌Fg180378。提取菌絲mRNA，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)。結(jié)果表明，有173個(gè)基因的表達(dá)存在顯著差異。其中86個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，87個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。與之前的研究比較，進(jìn)一步驗(yàn)證了FGSG09063在水楊酸代謝過(guò)程中的重要性;發(fā)現(xiàn)了一些與芳