鴨源雞桿菌的生物被膜形成能力及對雞原代輸卵管上皮作用的初步研究.pdf

1、雞桿菌屬(Gallibacterium)是革蘭氏陰性巴氏桿菌科中一個新屬，代表種為鴨源雞桿菌(Gallibacterium anatis，Ganatis)。鴨源雞桿菌是構(gòu)成雞上呼吸道和下生殖道常在菌群的一部分，具有條件致病性，與蛋雞輸卵管炎、輸卵管囊腫及腹膜炎等有關(guān)，引起雞產(chǎn)蛋量下降和死亡。近年來國內(nèi)外雖對鴨源雞桿菌進行了系列研究，但關(guān)于鴨源雞桿菌的體外生物被膜形成條件及其對雞原代輸卵管上皮細胞的作用尚未見報道。因此，為進一步揭示鴨源雞

2、桿菌引起雞輸卵管囊腫的相關(guān)機制，本研究擬探討鴨源雞桿菌的體外生物被膜形成條件和雞原代輸卵管上皮細胞的培養(yǎng)方法，并在此基礎(chǔ)上研究鴨源雞桿菌對雞的致病性和相關(guān)黏附與侵袋特性，初步揭示鴨源雞桿菌引起蛋雞輸卵管炎和腹膜炎的原因。
　　本文采用體外定量法檢測20株鴨源雞桿菌的被膜形成能力，并對被膜形成能力較強的1株鴨源雞桿菌在不同條件（培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基質(zhì)、營養(yǎng)條件）下產(chǎn)生生物被膜(Bacterialbiofilm，BF)的差異進行了研究。結(jié)

3、果顯示，大部分鴨源雞桿菌具有形成不同程度生物被膜的能力，其中3株被膜形成能力中等，2株形成能力較強;鴨源雞桿菌在銀染法、試管和96孔細胞培養(yǎng)板中形成BF的最佳培養(yǎng)時間分別是24 h、60 h和24 h。其生長周期為8h開始起始黏附、20 h大量黏附、24 h時形成完整的生物被膜、32 h生物被膜老化散播，之后起始新一輪的被膜形成周期。葡萄糖、蔗糖及NaCl均在一定程度上抑制了BF的形成，且隨著濃度的增加，NaCl對被膜形成抑制更顯著，而

4、低濃度的MgSO4在一定程度上促進BF的形成。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，生物被膜內(nèi)的菌體聚集成團塊狀、相互黏連形成致密的三維立體結(jié)構(gòu)。
　　為探討雞原代輸卵管上皮細胞分離培養(yǎng)方法，進一步研究鴨源雞桿菌對雞的致病性和相關(guān)侵襲特性，分別對消化酶、消化時間、取材部位和表面包被物等條件進行比較和優(yōu)化，篩選出雞原代輸卵管上皮細胞分離和純化的最佳方法，并對培養(yǎng)細胞進行鑒定與傳代。結(jié)果顯示，取雞輸卵管漏斗部，并用0.25％胰酶+0.02％ EDTA聯(lián)合

5、消化15 min、低速離心去除單細胞、差速貼壁除去成纖維細胞，在20％ FBS包被的細胞培養(yǎng)瓶中可獲得滿意的輸卵管上皮細胞分離效果，細胞貼壁性良好。培養(yǎng)的細胞在24 h時成團貼壁，48～60 h明顯增殖，呈圓形或多角形“鋪路石樣”的單層細胞生長，72 h后細胞增殖速度減慢，可以維持至10 d以上，且2次傳代后細胞貼壁生長良好。經(jīng)姬姆薩染色和透射電鏡觀察鑒定為雞輸卵管上皮細胞。本研究建立的雞原代輸卵管上皮細胞分離培養(yǎng)方法可獲得純度較高的目

6、的細胞。
　　為研究鴨源雞桿菌對雞原代輸卵管上皮細胞的作用，分別以細菌黏附、侵襲試驗及借助姬姆薩染色及掃描電鏡觀察2株不同來源的鴨源雞桿菌對輸卵管上皮細胞的黏附和侵襲特性。黏附計數(shù)表明鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附輸卵管上皮細胞，而菌株F149T對輸卵管上皮細胞有較低的黏附。慶大霉素保護試驗結(jié)果顯示2株菌對輸卵管上皮細胞均無可見侵襲力。姬姆薩染色及掃描電鏡試驗進一步證明輸卵管上皮細胞表面有細菌黏附，而內(nèi)部未見

7、有侵襲的細菌，但是Yu-PDS-RZ-1-SLG株接種細胞90 min后，細胞逐漸破碎脫落，而菌株F149T則未見明顯細胞損傷。菌株經(jīng)胰蛋白酶處理后，細菌的黏附率顯著降低，表明細菌的表面蛋白參與黏附。ELISA法檢測鴨源雞桿菌感染輸卵管上皮細胞后炎性細胞因子的變化，結(jié)果表明感染組的IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均高于對照組，且Yu-PDS-RZ-1-SLG感染的細胞所分泌的各細胞因子均高于F149T，提示炎性細胞因子的分泌可能改

8、變局部的微環(huán)境，促進細菌在輸卵管細胞表面增殖，是造成輸卵管上皮細胞損傷的機制之一。
　　為探索鴨源雞桿菌對輸卵管上皮細胞的損傷機制，分別用體外表達的溶細胞毒性的重組蛋白GtxA及其N端與C端結(jié)構(gòu)域作用于輸卵管上皮細胞，通過CCK-8及細胞因子檢測試劑盒測定細胞的受損程度和細胞因子的變化。結(jié)果表明重組蛋白GtxA不但能夠抑制輸卵管細胞的增殖，而且表現(xiàn)出明顯的細胞毒性作用，N端結(jié)構(gòu)域作為獨立的元件不能表現(xiàn)毒性作用，但是能夠促進毒素蛋白