用于制備抗菌肽的山羊成纖維細胞系與雞輸卵管上皮細胞系的建立.pdf

1、抗菌肽因具有廣譜殺菌、抗腫瘤、抗病毒和抗原蟲等特點而成為新型抗生素類藥物的研究熱點。為了加快抗菌肽的生產(chǎn)速度，提高抗菌肽的產(chǎn)量，本研究在克隆獲得中國林蛙皮膚抗菌肽基因Temporin-1CEa的基礎(chǔ)上，構(gòu)建山羊乳腺特異性表達載體pBC1-neo-Temporin-1CEa，將其線性片段導入山羊成纖維細胞中，通過G418篩選獲得轉(zhuǎn)抗菌肽基因的山羊成纖維細胞系;利用克隆獲得的雞輸卵管上皮特異表達調(diào)控序列5OV和Temporin-1CEa基因

2、，構(gòu)建雞輸卵管特異性表達抗菌肽的雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-GFP-5OV-Temporin1CEa;為了建立雞輸卵管基因表達調(diào)控的體外模型，在建立雞輸卵管封閉內(nèi)部消化法(Obturated Interior Digesting，OID法)的基礎(chǔ)上建立了雞輸卵管上皮細胞系;采用脂質(zhì)體法將pMX-GFP-5OV-Temporin1CEa載體轉(zhuǎn)染至雞輸卵管上皮細胞中，檢測其在細胞中的表達情況。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.山羊乳腺

3、特異性表達載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中的參照序列克隆Temporin-1CEa基因并將其連入pBC1-neo載體中，PCR鑒定、酶切鑒定及測序結(jié)果均顯示成功獲得山羊乳腺特異性表達載體pBC1-neo-Temporin-1CEa;
　　2.轉(zhuǎn)抗菌肽基因山羊成纖維細胞系的建立由山羊耳緣組織獲得的原代成纖維細胞傳代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入pBC1-neo-Temporin-1CEa線性片段，用含有300μ g/ml G418的培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)基因山羊

4、成纖維細胞;對獲得的細胞進行形態(tài)觀察，以及群體倍增時間、冷凍復蘇、染色體核型、細胞免疫組織化學等檢測，結(jié)果顯示本研究獲得了具有良好生長特性及遺傳穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)抗菌肽基因的山羊成纖維細胞系;
　　3.雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中的參照序列擴增技術(shù)克隆雞卵清蛋白基因的5'調(diào)控序列(5OV)，并將其與Temporin-1 CEa基因、GFP基因連入pMX載體中，PCR鑒定、酶切鑒定及測序結(jié)果均顯示成功構(gòu)建pMX-GFP-

5、5OV-Temporin1 CEa載體;
　　4.雞輸卵管上皮細胞系的建立本研究建立了分離培養(yǎng)雞原代輸卵管上皮細胞的OID法，并對獲得的原代上皮細胞進行了傳代培養(yǎng)、群體倍增時間、冷凍復蘇、染色體核型、細胞免疫組織化學、Marker基因表達及轉(zhuǎn)染能力等一系列的鑒定與檢測。其結(jié)果為:與現(xiàn)有的剪切法和刮取法無法獲得雞輸卵管上皮細胞系不同，采用OID法可以建立雞輸卵管上皮細胞系，且細胞具有正常的形態(tài)、良好的生長特性及穩(wěn)定性的遺傳特性;表明

6、本研究成功建立了雞輸卵管上皮細胞系，并命名為XYF-142;
　　5.雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與XYF-142細胞模型的檢測將pMX-GFP-5OV-Temporin-1CEa載體轉(zhuǎn)染至XYF-142細胞中后，觀察GFP基因的表達情況并檢測轉(zhuǎn)染細胞中Temporin-1CEa基因的轉(zhuǎn)錄情況;其結(jié)果顯示不僅在轉(zhuǎn)染細胞中觀察到GFP基因的表達，而且在轉(zhuǎn)染細胞總RNA中檢測到Temporin-1CEa基因的轉(zhuǎn)錄。表明本研究構(gòu)建的雞輸卵管特

7、異性表達Temporin-1CEa基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-GFP-5OV-Temporin-1CEa具有雙順反子特性;與此同時，表明本研究建立的雞輸卵管上皮細胞系XYF-142可以作為外源基因在雞輸卵管中表達調(diào)控的體外模型。
　　綜上所述，本研究成功獲得轉(zhuǎn)抗菌肽基因的山羊成纖維細胞系，并成功構(gòu)建雞輸卵管特異性表達Temporin-1CEa基因的雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-GFP-5 OV-Temporin-1CEa，及可作為