大熊貓和奶牛糞便中纖維素降解菌的篩選與鑒定.pdf

1、本研究以大熊貓和中國(guó)荷斯坦奶牛糞便為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用形態(tài)學(xué)觀察、菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)、菌株的分子鑒定及酶活性測(cè)定等方法，篩選大熊貓和奶牛糞便纖維素降解菌，旨在為尋找高效纖維素降解菌提供理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一：纖維素降解菌篩選。纖維素降解菌的篩選包括初篩和復(fù)篩兩個(gè)階段。初篩過程是將糞樣放入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中恒溫震蕩培養(yǎng)3 d，然后將發(fā)酵液稀釋并在固體培養(yǎng)基平板中涂布，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后將純化后的菌株滴加到固體培養(yǎng)基中再進(jìn)行培養(yǎng)

2、，之后用剛果紅染色進(jìn)行鑒定，選取透明水解圈較大的菌株。菌株的復(fù)篩主要是測(cè)定菌株的CMCase和FPAase兩種酶的酶活性，選取酶活性較高的菌株，進(jìn)行后續(xù)的鑒定。本實(shí)驗(yàn)分別從大熊貓和中國(guó)荷斯坦奶牛糞便樣本各篩選出5株纖維素降解菌。
　　實(shí)驗(yàn)二：纖維素降解菌鑒定。纖維素降解菌的鑒定包括形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定等三個(gè)方面。形態(tài)學(xué)觀察主要包括革蘭氏染色并觀察菌的形狀，觀察菌落的顏色、形狀、菌落大小、透明度、光澤度、質(zhì)地、邊

3、緣特征及隆起形狀等。生理生化實(shí)驗(yàn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》的有關(guān)方法進(jìn)行生理生化測(cè)定。包括糖醇的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、淀粉的水解實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)及硝酸鹽還原反應(yīng)等。分子生物學(xué)鑒定主要通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，測(cè)定基因序列，并與Genbank基因庫(kù)的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定菌株的種類。經(jīng)鑒定從大熊貓和中國(guó)荷斯坦奶牛糞便中篩選得到的纖維素降解株菌分別為白色鏈霉菌(NC020990)、假單胞菌（NC020209）、芽孢桿菌

4、(NC021171)、克雷伯菌(NC016612)、類芽孢桿菌(NC012914)和假單胞菌(NC020209)、志賀氏菌(NC007384)、菠蘿泛菌(NC013956)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(NC010943)及類芽孢桿菌(NC012914)。
　　實(shí)驗(yàn)三：酶活性優(yōu)化測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)酶活性優(yōu)化因素設(shè)定為5個(gè)，分別是培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH、接種量及裝液量。通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定菌株酶活性。大熊貓糞便中所篩選的菌株產(chǎn)酶條件及產(chǎn)酶結(jié)

5、果如下：白色鏈霉菌(NC020990)在pH為7，溫度35℃，裝液量30％，接種量2.5%，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm的條件下培養(yǎng)36 h, CMCase為最大值24.732 U。假單胞菌（NC020209）在pH為6，溫度25℃，裝液量30%，接種量4%，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm的條件下培養(yǎng)36 h，CMCase為最大值24.362 U。芽孢桿菌(NC021171)在pH為6.5，溫度30℃，裝液量30%，接種量2%，搖床轉(zhuǎn)速為180

6、rpm的條件下培養(yǎng)30h,CMCase為最大值23.125 U?？死撞?NC016612)在pH為6.5，溫度30℃，裝液量30%，接種量2%，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm的條件下培養(yǎng)42 h，CMCase為最大值18.642 U。類芽孢桿菌(NC012914) 在pH為7，溫度30℃，裝液量30%，接種量2%，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm的條件下培養(yǎng)48h，CMCase為最大值9.234 U
　　通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定

7、菌株酶活性，中國(guó)荷斯坦奶牛糞便中所篩選的菌株產(chǎn)酶條件及產(chǎn)酶結(jié)果如下：假單胞菌(NC020209)在pH為6，溫度25℃，裝液量30%，接種量4%，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm的條件下培養(yǎng)36 h, CMCase為最大值23.156 U。志賀氏菌(NC007384)在pH為7，溫度為35℃，裝液量40%，接種量2.5%，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm的條件下培養(yǎng)42h，CMCase為最大值21.842U。菠蘿泛菌(NC013956)在pH為6.5，

8、溫度30℃，裝液量30%，接種量3%，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm的條件下培養(yǎng)36h，CMCase為最大值10.624 U。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(NC010943)在pH為6.5，溫度35℃，裝液量30%，接種量2.5%，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm的條件下培養(yǎng)36 h，CMCase為最大值9.942 U。類芽孢桿菌(NC012914)在pH為7，溫度30℃，裝液量30%，接種量2%，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm的條件下培養(yǎng)48 h, CMCCase為