三疣梭子蟹pentraxin樣蛋白的克隆及生物學(xué)功能初步研究.pdf

1、Pentraxin是動(dòng)物進(jìn)化過程中產(chǎn)生的一類高度保守的血漿免疫蛋白質(zhì)超家族，分子特點(diǎn)是在其羧基端有段200個(gè)氨基酸殘基的保守序列，包含pentraxin的標(biāo)志性序列(HxCxS/TWxS，這里的x代表任意氨基酸殘基)?；趤喕闹饕Y(jié)構(gòu)的不同，將Pentraxin蛋白分為長型和短型2種不同的類型。CRP和SAP是典型的短型pentraxin，pentraxin3則是長型pentraxin的代表。Pentraxin家族成員在炎癥發(fā)生和機(jī)體

2、免疫反應(yīng)過程中都發(fā)揮著重要作用。目前pentraxin家族的研究主要集中在脊椎動(dòng)物領(lǐng)域，無脊椎動(dòng)物只在鱟中發(fā)現(xiàn)了pentraxin家族的成員CRP，三疣梭子蟹中未見相關(guān)報(bào)導(dǎo)。
　　在本研究中，我們首先從三疣梭子蟹中克隆pentraxin樣基因，由于該基因變異較大，通過同源蛋白設(shè)計(jì)簡并引物較困難，因此我們采用cDNA文庫篩選法篩選所需基因，成功得到pentraxin樣基因的全序列。其開放閱讀框編碼266個(gè)氨基酸殘基，SignalP4

3、.0 Server在線分析顯示N端25個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽，表明克隆的pentraxin樣蛋白是一個(gè)分泌蛋白。
　　運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步研究該基因的組織特異性分布（血細(xì)胞、肝胰臟、肌肉、眼、鰓、胃）以及副溶血弧菌誘導(dǎo)后血細(xì)胞中基因表達(dá)情況的變化。結(jié)果表明，pentraxin樣基因在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，菌體誘導(dǎo)后，基因表達(dá)趨勢(shì)為先下降后上升，在48小時(shí)后恢復(fù)原水平，表明該基因和機(jī)體的免疫反應(yīng)相關(guān)。
　　運(yùn)用基因工程手段

4、，構(gòu)建pentraxin樣基因的原核表達(dá)載體pET-28a-rPentraxin，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌transtta(DE3)感受態(tài)菌株得到重組pentraxin蛋白的基因工程菌株。IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)成功，分子條帶大小符合重組蛋白的預(yù)期且表達(dá)量較高。
　　確定重組蛋白表達(dá)后，采用鎳柱純化目的蛋白，得到重組蛋白粗品后再用腸激酶進(jìn)行酶切，去除融合的標(biāo)簽，再次利用鎳柱除去標(biāo)簽，得到pentraxin樣蛋白的純品，進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明p