巨尾桉Cu-ZnSOD銅分子伴侶的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）能清除植物體內(nèi)有害的活性氧（ROS），參與植株遭受逆境脅迫時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程。銅分子伴侶（CCS）是銅分子伴侶家族之一，它可以傳遞銅離子到Cu/ZnSOD當(dāng)中并將其激活生成有活性的酶分子，依賴CCS協(xié)助是Cu/ZnSOD主要的激活途徑。本文以巨尾桉作為研究對(duì)象，通過(guò)RT-PCR的方法克隆得到巨尾桉CCS基因7個(gè)(NCBI基因注冊(cè)號(hào)為：KJ755351.1)，龍眼CCS基因2個(gè)(NCBI基因注冊(cè)號(hào)為

2、：KR261666.1)。
　　生物信息學(xué)分析表明CCS蛋白是定位于葉綠體、親水、穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)，該蛋白含2個(gè)跨膜螺旋，N末端朝外，由內(nèi)到外進(jìn)行跨膜。該蛋白主要由59.6％的無(wú)規(guī)則卷曲、29.5%的β-折疊和11.0%的α-螺旋等構(gòu)成，并存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和保守結(jié)構(gòu)域，這些保守結(jié)構(gòu)域的存在可能是激活SOD表達(dá)所必須的。采用clustalX對(duì)來(lái)自12種不同物種的CCS核酸序列作進(jìn)化樹(shù)分析，巨尾桉CCS與龍眼、葡萄、蓖麻同源并處于同

3、一分支中，與它們間在進(jìn)化距離上較為接近，一致性分別為99%、81%和80%。
　　在巨尾桉CCS表達(dá)研究中，原核表達(dá)載體pET-EuCCS在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)CCS原核表達(dá)的優(yōu)化條件是：IPTG終濃度1mM，溫度37℃時(shí)，最佳誘導(dǎo)時(shí)間4h；而16℃和22℃誘導(dǎo)時(shí)，最佳誘導(dǎo)時(shí)間增加到12h和6h。利用氮藍(lán)四唑法（NBT）對(duì)含有外源載體pET-EuCCS和空載的E.coli的SOD酶活檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化菌株pET-E

4、uCCS的SOD酶活性比對(duì)照菌株高，說(shuō)明CCS激活了Cu/ZnSOD的表達(dá)，并且生成了有活性的蛋白質(zhì)，從而說(shuō)明外源基因EuCCS是具有生物學(xué)活性的。利用熒光定量PCR技術(shù)研究CCS在巨尾桉中的表達(dá)特性發(fā)現(xiàn)，在植株生長(zhǎng)旺盛的部位CCS表達(dá)量較大，如植株幼葉，隨植株葉片慢慢衰老，CCS的表達(dá)量也隨之下降；巨尾桉組培苗中，葉片的CCS表達(dá)量最大，其次是莖。
　　對(duì)含有外源基因pBI-EuSOD的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因巨尾桉植株SOD酶活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)比