尾巨桉揮發(fā)油含量測定及HMGR基因的克隆與表達分析.pdf

1、桉樹揮發(fā)油是世界產量最大的精油之一，廣泛運用于制藥、香料和工業(yè)行業(yè)。目前，國際市場的桉樹揮發(fā)油基本全部由中國提供，一方面人們對桉樹揮發(fā)油的需求越來越大，另一方面桉樹揮發(fā)油的產率卻低至1％左右，目前通過基因工程提高桉樹揮發(fā)油產率是一個有效的措施之一。因此，本研究提取尾巨桉不同組織的揮發(fā)油并對其中的1,8-桉葉素和β-桉葉醇含量進行測定;同時克隆了尾巨桉樹揮發(fā)油代謝途徑上的相關基因，為尾巨桉遺傳轉化和揮發(fā)油含量檢測提供理論依據(jù)。
　　

2、 本研究使用Clevenger apparatus分別提取尾巨桉根、莖和葉組織揮發(fā)油，結果表明葉的揮發(fā)油產量最高，其總油量為252.6mg·100g-1，出油率為0.25％；莖的總油量為18.2 mg·100g-1，出油率為0.018％，根中沒有揮發(fā)油存在。經(jīng)高效液相色譜檢測表明，1,8-桉葉素在葉和莖揮發(fā)油總量中分別占0.06％和0.04％；β-桉葉醇在葉和莖揮發(fā)油總量中分別占6.69％和11.5％，說明β-桉葉醇是尾巨桉揮發(fā)油的主

3、要成分之一，1,8-桉葉素含量相對較低。
　　 桉樹揮發(fā)油由單萜和倍半萜類化合物組成，通過甲羥戊酸(MVA)途徑和甲基赤蘚醇4-磷酸(MEP)途徑可形成單萜類化合物的前體物質香葉基二磷酸和倍半萜類化合物的前體物質法呢基二磷酸，香葉基二磷酸和法呢基二磷酸在其它酶的作用下發(fā)生去磷酸化、異構、環(huán)化和原子重排等反應形成揮發(fā)油的各種成分。本實驗通過cDNA末端快速擴增技術克隆了甲羥戊酸途徑上的第一個關鍵限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰CoA

4、還原酶(HMGR)基因，該基因全長1955 bp，包含66 bp的5'-UTR、329 bp的3'-UTR、poly A尾巴和1560 bp的開放閱讀框，該基因編碼519個氨基酸組成的蛋白質，其分子質量為55.1202 kD，理論等電點pI為5.37。通過在線NCBI中的Blast P比對分析表明，尾巨桉HMGR基因與青錢柳、橡膠樹、喜樹、沙梨的HMGR基因同源性均達100％。尾巨桉HMGR生物信息學分析表明：HMGR為疏水性蛋白質；位

5、于A60、A62、A63、A83、A111、A121、A147、A149、A191、A282、A344、A363、A437、A510、A511共15個絲氨酸殘基，A144、A197、A237、A350、A362共5個蘇氨酸殘基和A120、A158、A172共3個酪氨酸殘基是蛋白質翻譯后磷酸化修飾位點；存在1個信號肽，由位于A1～A25氨基酸殘組成，信號肽最有可能的酶剪切位于A25(Ser)殘基與第A26(Leu)殘基之間；亞細胞定位分析

6、表明，HMGR屬于次生代謝途徑上的分泌型酶，具有一信號肽；存在1個跨膜結構域位于A5(Ⅴ)～A27(Ⅰ)殘基之間；位于A167～A176氨基酸殘基和A196～A203氨基酸殘基分別存在一個HMG-CoA結合motif：EMPVGYVQLP和TTEGCLVA，其中TTEGCLVA中的谷氨酸(Glu)在HMGR催化中起著重要作用，位于A292～A298氨基酸殘基和A441～A447氨基酸殘基分別存在一個NADP(H)結合motif:RCDG

7、HEH和GTVGGGT；分子系統(tǒng)進化樹顯示，尾巨桉HMGR類聚于植物群，表明所得到的HMGR準確可靠；二級結構由47.40％的α-螺旋、15.41％的延伸鏈、7.13％的β-轉角、30.06％的無規(guī)卷曲組成。以人的HMGR為基礎進行同源建模得到尾巨桉HMGR三維空間構象呈“V”形，包含了N-結構域、S-結構域和L-結構域。
　　 HMGR基因結構分析表明，HMGR基因在基因組中存在一個大小為319 bp的內含子，尚不明確此內含子