褐飛虱內(nèi)參基因的篩選及精氨酸激酶基因的分子特性研究.pdf

1、褐飛虱Nilaparvatalugens(brownplanthopper，BPH)是水稻上的重要害蟲之一，在我國南方部分地區(qū)和長江中下游地區(qū)近年來褐飛虱經(jīng)常暴發(fā)成災(zāi)，對我國水稻生產(chǎn)和糧食安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前，對于褐飛虱的控制以化學(xué)防治為主，然而化學(xué)藥劑導(dǎo)致的環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，因此當(dāng)前害蟲防治的研究熱點(diǎn)集中在尋求環(huán)境友好的防止新途徑。與此同時(shí)，RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各種生物體基因功能的研究，這一技術(shù)成功地闡明了多種昆蟲的基因

2、功能。利用該技術(shù)分析基因功能的同時(shí)，也為農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治開辟了RNAi沉默靶標(biāo)基因的新途徑。在RNAi的研究過程中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析靶標(biāo)基因mRNA水平是檢測基因沉默效果的重要手段，本研究詳細(xì)分析評估了不同實(shí)驗(yàn)條件下（不同發(fā)育時(shí)期、不同組織部位、不同地理種群、不同溫度脅迫、不同藥劑處理、不同食物飼喂和饑餓處理）褐飛虱8種常用持家基因actin1(ACT)、muscleactin(MACT)、ribosomalproteinS

3、11(RPS11)、ribosomalproteinS15e(RPS15)、alpha2-tubulin(TUB)、elongationfactor1delta(EF)、18SribosomalRNA(18S)和argininekinase(AK)的表達(dá)穩(wěn)定性。并且，克隆褐飛虱nlak基因的全長cDNA，分析nlak基因mRNA的組織分布和發(fā)育表達(dá)模式，構(gòu)建昆蟲桿狀病毒重組質(zhì)粒表達(dá)NlAK重組蛋白，通過RNAi探討nlak基因作為分子靶

4、標(biāo)的可能性，為深入研究精氨酸激酶基因的表達(dá)與調(diào)控規(guī)律，闡明昆蟲體內(nèi)能量的代謝、貯存和利用等調(diào)控機(jī)制提供重要的理論依據(jù)，并且為利用RNAi這一新技術(shù)有效防治褐飛虱提供理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
　　一、褐飛虱內(nèi)參基因的篩選
　　不同發(fā)育時(shí)期各內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS15，RPS11，TUB，EF，18S，AK，ACT，MACT。若要采用多內(nèi)參校正，需要選取RPS15、TUB、18S和EF這四個(gè)基因;不

5、同組織部位各內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS11，TUB，RPS15，18S，ACT，MACT，EF，AK。若要采用多內(nèi)參校正，需要選取RPS11、18S和RPS15這三個(gè)基因;不同地理種群各內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:TUB，RPS11，EF，RPS15，AK，ACT，18S，MACT。采用多內(nèi)參校正時(shí)，需要選取RPS11、EF和RPS15這三個(gè)基因;不同溫度脅迫下各內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定

6、到不穩(wěn)定依次為:RPS15，TUB，EF，RPS11，AK，MACT，18S，ACT。采用多內(nèi)參校正時(shí)，需要選取RPS15、TUB和EF這三個(gè)基因;不同藥劑處理下各內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS11，EF，TUB，RPS15，18S，AK，MACT，ACT。采用多內(nèi)參校正時(shí)，需要選取RPS11、EF和TUB這三個(gè)基因;不同食物飼喂時(shí)各內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS15，TUB，RPS11，EF

7、，AK，18S，ACT，MACT。采用多內(nèi)參校正時(shí)，需要選取RPS15、TUB、EF和RPS11這四個(gè)基因;饑餓處理下各內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS11，TUB，RPS15，AK，18S，EF，ACT，MACT。采用多內(nèi)參校正時(shí)，需要選取RPS11、AK和EF這三個(gè)基因;對所有處理的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各內(nèi)參基因穩(wěn)定性的綜合排序從穩(wěn)定到不穩(wěn)定依次為:RPS11，RPS15，EF，TUB，AK，18S，A

8、CT，MACT。此結(jié)果對于褐飛虱中基因表達(dá)分析具有重要意義，并且為進(jìn)一步分析褐飛虱和其他生物內(nèi)參基因穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)。
　　二、褐飛虱精氨酸激酶基因的分子特性研究
　　1.褐飛虱精氨酸激酶基因(nlak)的克隆與分析
　　采用PCR、TA克隆、測序和拼接，獲得了nlak基因的完整編碼區(qū)序列，并通過5'-RACE和3'-RACE獲得5'端和3'端非翻譯區(qū)(UntranslatedRegions，UTR)序列?？寺〉降膎l

9、ak基因cDNA全長為1377bp，含有一個(gè)完整的1071bp的開放閱讀框序列（Openreadingframe，ORF），編碼356個(gè)氨基酸殘基。其中，CPTNLGT位于nlak氨基酸序列第270-276位，是精氨酸激酶的活性中心。根據(jù)Prosite軟件分析得出其蛋白質(zhì)分子量為39.81kDa，等電點(diǎn)為5.69。
　　2.重組AcNPV-NlAK在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)
　　將同源重組的AcNPV-NlAK病毒轉(zhuǎn)染健康的

10、昆蟲sf21細(xì)胞系，獲得第一代重組AcNPV-NlAK病毒。該重組病毒能夠繼續(xù)感染新的健康的sf21細(xì)胞，在感染后的第7天可以收集到重組AcNPV-NlAK蛋白。利用抗6-His兔多克隆抗體進(jìn)行WesternBlotting，檢測到重組NPV-NlAK蛋白在sf21細(xì)胞中成功表達(dá)。
　　3.nlak基因在褐飛虱體內(nèi)的表達(dá)分析
　　qRT-PCR和酶活性檢測結(jié)果表明nlak基因在褐飛虱各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，褐飛虱卵期的nlak

11、基因表達(dá)量遠(yuǎn)低于其他各個(gè)時(shí)期，1齡若蟲和2齡若蟲中表達(dá)量顯著高于其它齡期若蟲，并且在2齡若蟲中的表達(dá)量為整個(gè)發(fā)育時(shí)期最高。此外，在褐飛虱成蟲的各組織部位中nlak基因均有表達(dá)，無論在雌成蟲還是雄成蟲體內(nèi)，頭部的nlak基因表達(dá)量最高，其次是胸部，而腹部的表達(dá)量明顯低于頭部和胸部。并且，對于整個(gè)蟲體而言，nlak基因在雄成蟲體內(nèi)的表達(dá)量遠(yuǎn)大于雌成蟲。
　　4.nlak基因沉默后對褐飛虱的影響
　　采用飼喂法將體外合成的nlak

12、基因dsRNA通過人工飼料導(dǎo)入褐飛虱體內(nèi)，通過對死亡率的統(tǒng)計(jì)、qRT-PCR和酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，在飼喂初期dsRNA對nlak基因干擾效果比較明顯。不同濃度和不同片段的dsRNA飼喂結(jié)果均表明，攝取dsRNA的褐飛虱第2天出現(xiàn)死亡率上升、mRNA水平下降和酶活力降低的現(xiàn)象。第3天開始死亡率變化趨于平緩，第4天開始mRNA水平變化也趨于平緩，nlak基因的表達(dá)量隨著RNAi處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。
　　綜上所述，褐飛虱R