褐飛虱發(fā)育相關(guān)基因NlICP和Nlcdc2的克隆及功能研究.pdf

1、褐飛虱(Nilaparvata lugens St?l)是亞洲水稻種植區(qū)的重要害蟲之一,主要通過刺吸水稻組織汁液、產(chǎn)卵損傷葉鞘組織、傳播病蟲害等方式危害水稻。褐飛虱生長發(fā)育快,繁殖能力強,對農(nóng)藥和抗性水稻品種的適應(yīng)迅速,其防治一直是水稻生產(chǎn)的難題。鑒定持久有效的害蟲防治新靶標,對褐飛虱的防治具有重要意義。本文根據(jù)轉(zhuǎn)錄組和表達譜信息篩選出2個褐飛虱發(fā)育相關(guān)基因,分別注釋為表皮蛋白基因(NlICP)和細胞分裂周期基因(Nlcdc2),通過對

2、褐飛虱NlICP和Nlcdc2基因進行克隆,分析目標基因在發(fā)育過程中的表達規(guī)律,進而應(yīng)用 RNAi(RNA interference)對基因的功能進行研究,探討了目標基因在褐飛虱生長與生殖發(fā)育中的作用,目的是發(fā)現(xiàn)褐飛虱防治新靶標。研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　一、褐飛虱表皮蛋白基因NlICP的克隆及功能研究
　　根據(jù)褐飛虱表達譜和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息篩選出褐飛虱表皮蛋白基因NlICP,通過RT-PCR獲得NlICP核心序列片段。根據(jù)核

3、心序列片段設(shè)計RACE-PCR的引物并分別獲得5’端和3’端cDNA片段,通過DNAMAN進行序列拼接及全長cDNA的驗證,獲得NlICP全長cDNA。同源性分析發(fā)現(xiàn)NlICP編碼的氨基酸與其他物種的表皮蛋白具有較高同源性。
　　(1)褐飛虱 NlICP全長 cDNA序列含有一個完整585bp的 ORF(Open Reading Frame),編碼194個氨基酸,5’-UTR(Untranslated Regions)共112 b

4、p,3’-UTR共126 bp,具有典型的polyA結(jié)構(gòu),預(yù)測分子量為21.49 KDa,理論等電點為5.96,該蛋白具有表皮蛋白典型的R&R保守結(jié)構(gòu)域:CHIT_BIND_RR_2和CHIT_BIND_RR_1,SignalP3.0預(yù)測該蛋白含有長度為16個氨基酸的信號肽:MFTLLLVAALSGTVHS。
　　(2)熒光定量PCR對NlICP在褐飛虱不同發(fā)育階段進行轉(zhuǎn)錄水平的定量,結(jié)果表明NlICP在1~5齡若蟲中均有表達,在

5、3齡若蟲時表達量達到最高,而在成蟲體內(nèi)基本無表達,說明該表皮蛋白基因表達時期為若蟲期,屬于若蟲表皮蛋白基因。
　　(3)采用人工飼料飼喂進行NlICP基因的RNAi,取食dsNlICP的1齡末2齡初(孵化后第3天)若蟲在干擾6天和8天時,NlICP的表達量分別較取食dsGFP的對照組下降58.8％和45.6%,與對照有極顯著差異,說明RNAi具有顯著的干擾效果,導致表皮蛋白基因mRNA表達水平下降。干擾后部分褐飛虱因蛻皮不完全死亡

6、,干擾5天的存活率較對照下降26.7%。本研究結(jié)果提示,NlICP與褐飛虱若蟲的生長發(fā)育及蛻皮相關(guān),可以作為褐飛虱防治的潛在靶標基因。
　　二、褐飛虱Nlcdc2基因的克隆及功能研究
　　根據(jù)轉(zhuǎn)錄組信息的數(shù)據(jù)庫信息設(shè)計Nlcdc2基因特異性引物,通過RT-PCR獲得Nlcdc2核心序列片段。利用核心序列片段設(shè)計RACE-PCR的引物并獲得5’端和3’端cDNA片段,通過DNAMAN進行序列拼接及全長cDNA的驗證,獲得Nlc

7、dc2全長cDNA。同源性分析發(fā)現(xiàn)P34cdc2激酶與其他物種的CDK1具有高度同源性。
　　(1)褐飛虱Nlcdc2全長cDNA序列含有一個完整909 bp的ORF,編碼302個氨基酸,5'-UTR共182 bp,3'-UTR共124 bp,具有典型的polyA結(jié)構(gòu),預(yù)測分子量為34.70 KDa,理論等電點為7.60,該蛋白具有蛋白激酶的特征位點:參與ATP綁定的元件GXGXXGXV,催化位點DFG和Lys33;P34cdc2

8、激酶的保守區(qū)PSTAIR區(qū);磷酸化位點Thr14,Tyr16,Thr161和四個色氨酸殘基Try168, Try188,Try228,Try244。
　　(2)熒光定量PCR對Nlcdc2在褐飛虱不同發(fā)育階段進行轉(zhuǎn)錄水平的定量,結(jié)果表明Nlcdc2在整個發(fā)育過程均有表達,在羽化后3~5天表達量達到最高,說明Nlcdc2表達高峰期在褐飛虱卵巢發(fā)育時期,該基因與褐飛虱的卵巢發(fā)育、繁殖具有重要關(guān)系。
　　(3)對5齡若蟲Nlcdc