甜菜夜蛾2個(gè)氣味結(jié)合蛋白基因的克隆、表達(dá)特征及功能分析.pdf

1、在長期的進(jìn)化過程中，昆蟲形成了復(fù)雜而敏銳的嗅覺系統(tǒng)，藉此感受環(huán)境中大量的化學(xué)信息，并做出相應(yīng)的生理和行為反應(yīng)，如取食、交配和產(chǎn)卵。大量研究證實(shí)，氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding protein，OBP)是高濃度存在于昆蟲觸角感器腔內(nèi)的一類水溶性小分子蛋白，起到將外來脂溶性氣味物質(zhì)結(jié)合并運(yùn)輸?shù)礁惺苌窠?jīng)膜上的氣味受體的作用。甜菜夜蛾Spodoptera exigua屬鱗翅目、夜蛾科，是一種重要的多食性農(nóng)業(yè)害蟲，對其OBP的研究，

2、不僅有助于深入了解甜菜夜蛾的嗅覺機(jī)制，而且可以為開發(fā)基于嗅覺調(diào)控的新型防治技術(shù)提供靶標(biāo)，具有非常重要的意義。本研究通過對甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，從甜菜夜蛾中克隆了2個(gè)氣味結(jié)合蛋白OBP基因，測定了它們的組織及時(shí)間表達(dá)動(dòng)態(tài)，然后利用體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)、熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對其生理功能進(jìn)行了探索。主要結(jié)果如下:
　　1甜菜夜蛾2個(gè)OBP基因的克隆及序列分析
　　通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得了2個(gè)OBP基因的cD

3、NA片段，然后利用RACE技術(shù)，進(jìn)一步克隆了其cDNA全長序列。其中一個(gè)基因命名為SexiOBP13，GenBank登錄號KC817145;另一個(gè)基因被他人登錄，命名為SexiOBP7，登錄號為JX962790.1。序列分析表明，兩個(gè)OBP均具有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)等OBP的典型特征，并且與其它夜蛾科昆蟲OBP具有較高的相似性，其中SexiOBP7和棉鈴蟲的HarmOBP2一致性最高為87％，SexiOBP13和?；页嵋苟甑腟litO

4、BP23一致性最高為80％。SexiOBP7開放閱讀框429 bp，編碼143個(gè)氨基酸，其中N端21個(gè)氨基酸為信號肽序列，成熟蛋白的分子量為16.34 kDa、等電點(diǎn)為8.88。SexiOBP13開放閱讀框438bp，編碼146個(gè)氨基酸，N端前24個(gè)氨基酸為信號肽，成熟蛋白的分子量為15.41 kDa、等電點(diǎn)為6.71。
　　2甜菜夜蛾OBP7和OBP13的組織和時(shí)間表達(dá)動(dòng)態(tài)分析
　　表達(dá)動(dòng)態(tài)分析是了解基因功能的重要途徑。利

5、用qPCR技術(shù)首先檢測了2個(gè)基因在幼蟲頭部和身體、雌雄成蟲不同組織的表達(dá)量。結(jié)果表明，OBP7在幼蟲期僅頭部有微量表達(dá);成蟲期則在雌雄觸角高表達(dá)，其他組織基本不表達(dá)。OBP13在幼蟲期頭部高表達(dá)，其他組織基本不表達(dá);在成蟲期不表達(dá)。進(jìn)一步測定了OBP7在成蟲雌雄觸角不同日齡及OBP13在幼蟲頭部不同齡期的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OBP7在雄蟲觸角中的表達(dá)量在3日齡達(dá)到最高，在雌蟲觸角中的表達(dá)量在1日齡、4日齡相對較高;OBP13在幼蟲頭部的表

6、達(dá)量以3齡最高，3齡后顯著降低。據(jù)此我們推測，2個(gè)基因分別在甜菜夜蛾幼蟲和成蟲的嗅覺或味覺中起重要作用。
　　3甜菜夜蛾OBP7和OBP13的原核表達(dá)及純化
　　為進(jìn)一步探索甜菜夜蛾OBP7和OBP13的功能，利用原核表達(dá)系統(tǒng)對2個(gè)基因進(jìn)行了體外大量表達(dá)和純化。首先構(gòu)建了2個(gè)基因的pET-30a(+)表達(dá)載體，然后在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行大量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析、腸激酶酶解及親和層析再純化等步驟，得到切除Hi

7、s-tag的純化OBP7和OBP13蛋白。誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析表明，pET/SexiOBP7和pET/SexiOBP13分別在約22kDa、21kDa處有一明顯加粗條帶，和預(yù)期大小基本一致，且2個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物都以可溶性形式存在。純化的重組蛋白經(jīng)冷凍干燥后用于后續(xù)功能分析。
　　4甜菜夜蛾OBP7和OBP13的配體結(jié)合能力分析
　　選定1-NPN為實(shí)驗(yàn)用探針，利用熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定了OBP7和OBP13重組蛋白對

8、包括甜菜夜蛾性信息素及多種植物揮發(fā)物在內(nèi)共37種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OBP7對乙酸壬酯、橙花叔醇、β-紫羅蘭酮的結(jié)合能力較強(qiáng)，Ki值分別22.81μM、22.03μM和9.49μM; OBP13則對Z9，E12-14:Ac、Z9，E12-14:OH、橙花叔醇、法尼醇的結(jié)合能力較強(qiáng)，Ki值3.82μM、16.39μM、27.59μM、24.01μM，其中，對Z9，E12-14:Ac的結(jié)合能力最強(qiáng)。因此，OBP7在甜菜夜蛾成蟲對β

9、-紫羅蘭酮等寄主植物氣味的識別定向中起作用;OBP13則在幼蟲對Z9，E12-14:Ac的識別中起作用。
　　5甜菜夜蛾幼蟲對性信息素組分Z9，E12-14:Ac的趨向行為測定
　　根據(jù)配體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，推測甜菜夜蛾幼蟲可能對性信息素組分Z9，E12-14:Ac具有感受能力。為了驗(yàn)證這一推測，進(jìn)一步進(jìn)行取食選擇實(shí)驗(yàn)，測定了甜菜夜蛾3齡幼蟲對Z9，E12-14:Ac的行為反應(yīng)。結(jié)果表明，幼蟲對于添加了性信息素組分的人工飼料具有