松墨天牛氣味結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析及表達(dá)分析.pdf

1、昆蟲的嗅覺系統(tǒng)是一套非常精密的化學(xué)感受系統(tǒng)，能夠精確地接收外界的化學(xué)氣味，進(jìn)而調(diào)控昆蟲的各類生命活動(dòng)，在昆蟲的體內(nèi)有蛋白通過與外界氣味物質(zhì)結(jié)合，將其傳輸?shù)礁惺芷?，稱之為氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein，OBP)，它在昆蟲嗅覺識(shí)別過程中有著舉足輕重的作用。松墨天牛（Monochamusalternatus）是松樹的危害性極高的柱干類害蟲，同時(shí)也是松材線蟲病的媒介昆蟲，每年都有大量松樹受其危害，對(duì)生態(tài)環(huán)境具有嚴(yán)重

2、的威脅。
　　目的：
　　現(xiàn)如今，人們對(duì)松墨天牛的認(rèn)識(shí)尚不夠全面，在NCBI登陸的信息量滿足不了對(duì)其嗅覺識(shí)別機(jī)制的研究，因此對(duì)松墨天牛進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)篩選出來的氣味結(jié)合蛋白進(jìn)行初步研究，為深入研究松墨天?；瘜W(xué)感受機(jī)制，氣味結(jié)合蛋白的功能以及開發(fā)新型防治技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析松墨天牛的核苷酸和蛋白序列，并從中篩選氣味結(jié)合蛋白;
　　2.

3、運(yùn)用SingalP分析信號(hào)肽，通過Clustal W做保守性分析，用Protein Date BankPBD和Swiss-Model進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，利用MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;
　　3.運(yùn)用qPCR技術(shù)對(duì)松墨天牛氣味結(jié)合蛋白發(fā)育及組織的表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)與分析。
　　結(jié)果和結(jié)論：
　　1.通過華大基因公司對(duì)松墨天牛進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，統(tǒng)計(jì)共組裝獲得72223個(gè)Contig，35601個(gè)Unigene，運(yùn)用blastx比

4、對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)NR，Swiss-Prot，KEGG，COG，對(duì)獲得的所有Unigene進(jìn)行功能注釋.我們從中篩選出33個(gè)可靠性高的氣味結(jié)合蛋白，根據(jù)保守氨基酸殘基Cys的數(shù)目和它們的相對(duì)位置把它們劃分至Classic OBP屬，Minus-C OBP屬，Plus-C OBP屬，Atypical OBP屬以及Dimer OBP屬，將它們與松墨天牛已知的氣味結(jié)合蛋白進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)只有OBP1和OBP2在NCBI上有登錄，蛋白登錄號(hào)分別為ABR

5、53888.1和AHA39267.1，剩余的都尚未被收錄，此次測(cè)序完善了松墨天牛的轉(zhuǎn)錄組信息，擴(kuò)展了松墨天牛氣味結(jié)合蛋白的數(shù)目。
　　2.在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，將篩選出的33個(gè)氣味結(jié)合蛋白進(jìn)行信號(hào)肽檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大部分的氣味結(jié)合蛋白在N末端都存在一段10-25個(gè)氨基酸殘基組成的序列，它們指引著氣味結(jié)合蛋白在淋巴液中輸送氣味物質(zhì);通過Clustal W軟件對(duì)這些氣味結(jié)合蛋白進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)至少有4個(gè)保守的半胱氨酸存在，運(yùn)用在線工具Prot

6、ein Date Bank PBD和Swiss-Model對(duì)它們進(jìn)行3-D結(jié)構(gòu)的模擬預(yù)測(cè)，半胱氨酸殘基組成的二硫鍵將氣味結(jié)合蛋白內(nèi)的α螺旋連接起來，支撐起了氣味結(jié)合蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，故這些氣味結(jié)合蛋白在蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的層次上又具有相似性。將NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已登陸的昆蟲氣味結(jié)合蛋白序列同松墨天牛這些氣味結(jié)合蛋白序列混編在一起，采用MEGA5.1軟件鄰位相連法(Neighbour-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)松墨天牛的氣味結(jié)合蛋白坐

7、落在系統(tǒng)進(jìn)化樹的不同區(qū)域，這些足以說明松墨天牛的氣味結(jié)合蛋白序列同源性較低，彼此間分化程度較高，擁有相對(duì)獨(dú)特的進(jìn)化趨勢(shì)，這也許是松墨天牛的氣味結(jié)合蛋白對(duì)不同氣味物質(zhì)具有特異性的原因。
　　3.松墨天牛的發(fā)育主要分三個(gè)階段:幼蟲，蛹，成蟲。無論雌雄個(gè)體，絕大多數(shù)氣味結(jié)合蛋白都是在成蟲階段開始大量表達(dá)，不過也有些其他情況存在。例如:雄蟲方面，OBP6，OBP10，OBP23，OBP28，OBP30這幾個(gè)基因幼蟲的表達(dá)量最高，OBP2，

8、OBP19，OBP24，OBP26在蛹階段出現(xiàn)最高值;雌蟲方面蛹的表達(dá)量最高的有OBP2，OBP19，OBP23，OBP26，OBP30在整個(gè)發(fā)育過程中表達(dá)譜未發(fā)生太大變化，OBP6幼蟲階段與成蟲階段表達(dá)譜持平，OBP28則是幼蟲有表達(dá)峰值。在松墨天牛的發(fā)育過程當(dāng)中，成蟲階段有著各種復(fù)雜的生命活動(dòng)，而與之緊密相連的氣味結(jié)合蛋白，大多數(shù)都在成蟲開始出現(xiàn)高表達(dá)，幼蟲階段有些必須進(jìn)行的活動(dòng)，也會(huì)存在少許氣味結(jié)合蛋白的高表達(dá)，而蛹階段為羽化做準(zhǔn)

9、備，必不可少的需要一些氣味結(jié)合蛋白的參與。由此，我們可以通過松墨天牛氣味結(jié)合蛋白的表達(dá)譜推測(cè)某些氣味結(jié)合蛋白跟哪個(gè)發(fā)育階段的活動(dòng)息息相關(guān)。
　　4.運(yùn)用qPCR技術(shù)對(duì)松墨天牛OBP2和OBP6在不同組織中（觸角，頭部，下顎須，下腹末端，足部）的表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)與分析。各組織間表達(dá)存在顯著差異，OBP2在頭部表達(dá)最高，觸角和足部次之，下腹末端再次之，下顎須最低;OBP6在下腹末端跟下顎須最高，足部和頭部次之，觸角最低。不同于傳統(tǒng)觀點(diǎn)氣