豬TLR3基因及SP-C、SP-D基因啟動(dòng)子功能分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)引起的一種病毒性傳染病。PRRS導(dǎo)致妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙，仔豬高死亡率以及各年齡段尤其是仔豬的呼吸道疾病。有研究表明我國(guó)優(yōu)良地方品種大蒲蓮豬對(duì)藍(lán)耳病的抗性比西方豬種杜長(zhǎng)大雜交豬高。我們分析了感染PRRSV對(duì)模式識(shí)別受體TLR3（Toll-like receptor3TLR3）m

2、RNA表達(dá)的影響;對(duì)TLR3基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了克隆;對(duì)大蒲蓮豬、萊蕪豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬四個(gè)品種301個(gè)樣品啟動(dòng)子區(qū)的SNPs（Single nucleotide polymorphisms）進(jìn)行了檢測(cè);對(duì)TLR3基因的調(diào)控進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明:
　　1.通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)將豬的TLR3基因氨基酸序列與該基因其他物種氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其和哺乳動(dòng)物（包括人、猴、馬、小鼠、狗、綿羊、牛、黑猩猩）的同源性較高，其次是雞，而與斑

3、馬魚(yú)的同源性較低。
　　2.利用RT-PCR進(jìn)行表達(dá)譜分析，結(jié)果顯示，TLR3基因在肝、腎、胃、脾、脾中均有明顯的表達(dá)，而在心臟、子宮、淋巴結(jié)、大腦、肌肉、大腸、小腸和肺中有弱表達(dá)，在小腦、扁桃體中幾乎檢測(cè)不到其表達(dá)。
　　3.利用熒光定量PCR分析了大蒲蓮豬及杜大長(zhǎng)雜交豬感染PRRSV前后肺臟組織中模式識(shí)別受體TLR3的mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TLR3基因在大蒲蓮豬和杜大長(zhǎng)雜交豬的表達(dá)上存在顯著差異(P=0.0351)。攻毒

4、前后，大蒲蓮豬表達(dá)量均高于杜大長(zhǎng)雜交豬。攻毒對(duì)于兩種豬的影響不同，大蒲蓮豬在攻毒后TLR3 mRNA表達(dá)量升高，杜大長(zhǎng)雜交豬在攻毒后表達(dá)量下降。
　　4.分別用內(nèi)切酶酶切法和PCR法構(gòu)建不同長(zhǎng)度的載體，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)不同長(zhǎng)度載體的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子長(zhǎng)度在2.9 kb～2.1 kb和1.6 kb～0.6 kb是調(diào)控豬TLR3基因表達(dá)水平的重要區(qū)段。
　　5.TLR3基因的5'調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上

5、游-2603 bp～-2177 bp處有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的功能(P＜0.001)，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)在-2170 bp處存在轉(zhuǎn)錄因子AP-1結(jié)合位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)在此處存在A/C多態(tài)，并且由A→C突變引起轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-的結(jié)合。定點(diǎn)突變TLR3基因-2170位點(diǎn)(A→C）改變c-Ets-的結(jié)合位點(diǎn)，突變型mutPRE的熒光素酶活性升高，但是不顯著。
　　6.檢測(cè)70頭大蒲蓮豬、48頭萊蕪豬、119頭長(zhǎng)白豬、64頭杜洛克豬的重要調(diào)控區(qū)-2952 b

6、p～-2177 bp的SNPs，在本地豬品種中CC型和AC型為優(yōu)勢(shì)基因型。西方商品豬的AA型為優(yōu)勢(shì)基因型。以上四種豬都不符合哈代溫伯格平衡(P＜0.05)。
　　肺泡表面活性物質(zhì)(Pulmonary Surfactant，PS)，是由Ⅱ型肺泡細(xì)胞分泌的，能與表面活性物質(zhì)蛋白特異性結(jié)合。它是一種由磷脂、中性脂肪和特異性蛋白組成的復(fù)合物，對(duì)于降低肺泡表面張力、維持肺的順應(yīng)性起重要作用。我們尋找并獲得了表面活性蛋白SP-C、SP-D基因

7、啟動(dòng)子，并證明其在肺組織中特異性表達(dá)，結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了豬肺泡表面活性物質(zhì)SP-C基因紅色熒光蛋白表達(dá)載體，在肺組織中檢測(cè)到紅色熒光蛋白表達(dá)，而肌肉(C2C12)、脂肪(3T3-L1)等組織細(xì)胞中檢測(cè)不到熒光蛋白表達(dá)，因此表明SP-C基因啟動(dòng)子只有在肺組織中特異性表達(dá)。
　　2.構(gòu)建了豬肺泡表面活性物質(zhì)SP-D基因紅色熒光蛋白表達(dá)載體，在肺組織中檢測(cè)到紅色熒光蛋白表達(dá)，而肌肉(C2C12)、脂肪(3T3-L1)等組織

8、細(xì)胞中檢測(cè)不到熒光蛋白表達(dá)，因此表明SP-D基因啟動(dòng)子只有在肺組織中特異性表達(dá)。
　　綜上所述，本研究初步表明TLR3基因的差異表達(dá)可能與大蒲蓮豬對(duì)PRRS的抗性有關(guān)，并對(duì)TLR3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行了分析，找到了重要的調(diào)控基因表達(dá)的元件;通過(guò)對(duì)不同豬種的TLR3基因啟動(dòng)子重要調(diào)控區(qū)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)本地豬中和西方豬種有不同的SNPs;構(gòu)建了構(gòu)建了豬肺泡表面活性物質(zhì)SP-C、SP-D基因紅色熒光蛋白表達(dá)載體，驗(yàn)證了其在肺組織中特異性表達(dá)