規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場布魯氏菌病血清學調(diào)查與間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、近年來，我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展勢頭迅猛，奶牛養(yǎng)殖正朝向規(guī)?；图s化方向發(fā)展，奶牛布魯氏菌病引發(fā)的流產(chǎn)等各種問題在規(guī)模化牧場中日益嚴重。缺乏奶牛布魯氏菌病的流行病學數(shù)據(jù)是我國控制牛布魯氏菌病的重要障礙之一。布魯氏菌第一組外膜蛋白omp10、omp16和omp19被證明為良好的免疫原性，是亞單位疫苗的熱門候選，是重要的毒力蛋白;本實驗擬利用實驗室保存的第一組外膜蛋白作為診斷抗原，建立一種針對牛血清布魯氏菌抗體的間接ELISA檢測方法。

2、　　自2011年1月-2013年6月，實驗室收到送檢和采集的全國范圍內(nèi)的規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場血樣樣本進行虎紅平板凝集實驗，對養(yǎng)殖場大群和流產(chǎn)奶牛進行初步的篩查。將實驗室保存的質(zhì)粒pEASY-T3-omp10、pEASY-T3-omp16和pEASY-T3-omp19經(jīng)克隆、酶切、鑒定，重新連接pET-32a(+)表達載體，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)分別表達重組蛋白pET-32a-omp10、pET-32a-omp16和pET-32a-omp19，

3、經(jīng)SDS-PAGE及Western-blot分析鑒定后，采用Ni-NTA Spin Kit純化重組蛋白，分別利用純化獲得的重組蛋白進行包被，嘗試構建幾種間接ELISA檢測方法，成功建立的方法進行臨床血清的檢測（實驗室保存的251份臨床血清），檢測結果與RBPT進行對比，判斷建成方法的特異性、敏感性和準確性。
　　虎紅檢測奶牛血清樣本共計5575份，陽性血清1036份，占檢測樣本總數(shù)的18.58％。其中，群檢奶牛血清樣本4980份，

4、陽性樣本792份，虎紅陽性率為15.90％;流產(chǎn)奶牛血清樣本595份，陽性樣本244份，虎紅陽性率為41.01％。成功表達純化重組蛋白omp10、omp16和omp19，以omp16為包被抗原建立的iELISA檢測方法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點，與虎紅平板凝集試驗的符合率可達86.57％;而omp10和omp19在方法建立的過程中出現(xiàn)陽性血清不同梯度OD值差異不大，陰性血清OD值與梯度無關的情況，陰陽性血清的OD450值的商值(P/N

5、)差異很?。ㄐ∮?），無論如何改變抗原和血清稀釋度，這一情況都沒有得到改善，故omp10和omp19未能成功構建檢測方法。
　　全國范圍內(nèi)，布魯氏菌病的發(fā)病情況比較嚴重，而且范圍很廣，呈現(xiàn)上升趨勢，布魯氏菌病引起的奶牛流產(chǎn)，在各種流產(chǎn)因素中占據(jù)很大比例。成功構建的omp16 iELISA方法穩(wěn)定、可靠，可作為奶牛布魯氏菌病血清學候選方法，同時為omp16免疫原性和抗感染保護作用的進一步研究奠定了基礎;omp10和omp19不適合作