雞沙門菌病抗體間接ELISA檢測方法的建立.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、雞沙門菌病在我國仍然廣泛流行,嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)。外表健康的患雞容易向外排菌,使雞蛋、雞肉等產品遭受污染,給食品安全和公眾健康帶來一定的危險,容易造成人食物中毒。
   由于沙門菌感染后能終身帶菌,并可通過種蛋垂直傳給雛雞,因此鑒定并淘汰陽性種雞十分必要。長期以來,養(yǎng)雞場一直使用玻板凝集試驗檢測淘汰患雞白痢、雞傷寒的病雞,但是該方法敏感性有限,經常漏檢。感染雞間歇性排毒或不排毒,使得傳統(tǒng)分菌的方法不夠敏感。感染性沙門菌血清型眾多,傳

2、統(tǒng)ELISA方法不能滿足實際需求。
   沙門菌InvJ蛋白是廣泛存在于沙門菌中的保守蛋白,使用該蛋白檢測沙門菌抗體,可以有效地檢出被沙門菌感染的雞。因此,本試驗采用分子克隆方法,得到InvJ蛋白,將其作為檢測抗原,研制出能檢測沙門菌InvJ抗體的間接ELISA方法,現(xiàn)將結果報告如下。
   1.沙門菌InvJ基因的克隆與融合蛋白的表達同源性分析顯示沙門菌InvJ蛋白和其他細菌的蛋白同源性低,在沙門菌中是一個保守蛋白。根

3、據(jù)Genbank(CP003047)上公布的雞傷寒/白痢沙門菌InvJ序列設計引物,成功在腸炎沙門菌標準株(CVCC3375)中擴增得到InvJ基因,將該基因連接到pET-28a(+)表達載體,構建融合質粒pET-in4,將該質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,成功誘導出融合蛋白。Western-blot結果顯示該蛋白具有良好的免疫原性。
   2.檢測沙門菌InvJ抗體的間接ELISA方法的建立使用純化后的融合蛋白包被酶標板

4、,建立間接ELISA方法,經試驗確定最佳檢測條件:包被濃度為0.17μg/mL,包被液為磷酸鹽緩沖液(20mmol/L,pH7.0),4℃包被12h,使用5%脫脂奶粉作為封閉液,37℃封閉90min,使用PBST將待檢血清稀釋800倍檢測,血清孵育時間為45min,二抗孵育時間45min,顯色時間為15min,陽性臨界值為0.162。
   重復性試驗結果顯示該方法重復性良好。使用所建方法對9個雞場655份血清進行了檢測,陽性率

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