葡萄根瘤蚜翅型分化相關(guān)基因的克隆及其影響因素研究.pdf

1、葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae Fitch)是葡萄上的專性寄生害蟲。2005年我國再次發(fā)現(xiàn)葡萄根瘤蚜，這對我國葡萄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了巨大威脅，而有翅蚜和葉癭型根瘤蚜的產(chǎn)生將會加速葡萄根瘤蚜的傳播，所以研究葡萄根瘤蚜的翅型分化機(jī)理具有重要意義。本文對葡萄根瘤蚜翅型分化相關(guān)基因三磷酸腺苷雙磷酸酶Apyrase進(jìn)行了克隆分析，并用熒光定量PCR技術(shù)研究了Appyrase基因在不同齡期有翅、無翅根瘤蚜中的表達(dá)差

2、異;同時對激素和環(huán)境因子對葡萄根瘤蚜翅型分化的影響進(jìn)行了初步探討。主要結(jié)果如下:
　　1.葡萄根瘤蚜翅型分化相關(guān)基因DvApyrase的克隆、分析
　　利用RT-RACE技術(shù)，首次從葡萄根瘤蚜中克隆得到了葡萄根瘤蚜的翅型分化相關(guān)基因，并對其全長cDNA序列進(jìn)行了分析。該基因?qū)儆谌姿嵯佘针p磷酸酶超基因家族(Apyrase superfamily)，我們將其命名為DvApyrase，GenBank注冊號:KJ725377。該基

3、因cDNA序列全長1199bp，包括一個1071bp的開放閱讀框、63bp的5'非編碼區(qū)及65bp的3'非編碼區(qū)，其開放閱讀框編碼一個356aa的多肽，分子量大約為39.68kD。對其氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在1-20氨基酸之間有典型的疏水區(qū)域，但是不存在典型的跨膜區(qū)，推測該蛋白是一個膜外周結(jié)合蛋白。通過同源性比較發(fā)現(xiàn)，該蛋白的氨基酸序列與其它昆蟲的氨基酸序列同源性在40％-50％之間。進(jìn)化分析表明，葡萄根瘤蚜DvApyrase與來源于

4、豌豆蚜的SCAN聚類于同一分支，親緣關(guān)系最近。
　　運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)分析了DvApyrase基因在葡萄根瘤蚜有翅、無翅蚜各齡期的相對表達(dá)量，結(jié)果表明:DvApyrase基因在有翅蚜各齡期的表達(dá)量均顯著高于對應(yīng)無翅齡期，且在翅型分化的關(guān)鍵齡期（有翅2齡）高表達(dá)，是無翅2齡的13.62倍，達(dá)到了極顯著水平，之后隨有翅蚜齡期的增長而逐漸下降。這說明DvApyrase基因在葡萄根瘤蚜翅型分化過程中可能起著關(guān)鍵作用。
　　2.激

5、素對葡萄根瘤蚜翅型分化的影響分析
　　(1)早熟素PⅡ?qū)Τ嵝头只挠绊?用點滴法處理時，在1ng/μl-100ng/μl濃度范圍內(nèi)，處理組有翅蚜數(shù)量均顯著高于對照，且隨著PⅡ濃度的提高，有翅率顯著上升;用飼喂法處理時，在PⅡ濃度為1ng/μl時，處理組有翅蚜比率與對照組相比沒有明顯差異，但當(dāng)濃度增大到100ng/μl時，有翅蚜比例也顯著提高。可見，PⅡ?qū)ζ咸迅鲅恋某嵝头只哂写龠M(jìn)作用。
　　(2)保幼激素JHⅢ對翅型分化的

6、影響:用點滴法處理時，在0.1ng/μl-10ng/μl濃度條件下，有翅蚜率顯著低于對照，但當(dāng)濃度再增加時，有翅率繼續(xù)減少，但差異不再顯著;用飼喂法處理時，當(dāng)濃度增大到10ng/μl時，有翅率也會顯著下降?？梢?，JHⅢ對葡萄根瘤蚜翅型分化具有明顯的抑制作用。
　　3.環(huán)境因子對葡萄根瘤蚜翅型分化的影響分析
　　以1齡若蟲為材料，就蟲口密度、培養(yǎng)溫度和寄主類型對其翅型分化的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，葡萄根瘤蚜有翅蚜率隨著蟲口密