蘇云金芽孢桿菌cry5Ba3基因的表達及對松材線蟲的毒殺效果研究.pdf

1、松材線蟲?。˙ursaphelenchus xylophilus）是一種毀滅性的松樹病害。cry5Ba3是本實驗室從蘇云金芽孢桿菌zjfc85上克隆獲得的新型毒蛋白基因，其編碼的蛋白對松材線蟲具有顯著的毒殺活性。為了進一步明確cry5Ba3基因編碼的殺蟲晶體蛋白的功能，本研究構(gòu)建了經(jīng)序列優(yōu)化的cry5Ba3基因的表達質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，將cry5Ba3Φ基因整合至灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的基因組中，通過

2、生測實驗，明確了轉(zhuǎn)cry5Ba3Φ基因灰葡萄孢對松材線蟲的毒力。取得以下結(jié)果：
　　1.根據(jù)絲狀真菌密碼子的偏好性，對cry5Ba3基因進行全基因改造。調(diào)整了567個堿基，使得該基因的密碼子在真菌中獲得最高翻譯效率，改造后的基因命名為cry5Ba3Φ。
　　2.通過體外序列合成的方法，將 trpC啟動子序列、cry5Ba3基因序列以及trpC終止子序列連接到pUC-57質(zhì)粒上，獲得pUC57-cry5Ba3Φ。通過酶切將其連

3、接到pTFCM質(zhì)粒，獲得根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pTFCM-cry5Ba3Φ。
　　3.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將含質(zhì)粒pTFCM-cry5Ba3Φ的根癌農(nóng)桿菌 AGL-1與灰葡萄孢野生型菌株共培養(yǎng)，在含潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選獲得5個轉(zhuǎn)化子。PCR驗證和Southern雜交試驗表明cry5Ba3Φ基因單拷貝整合到灰葡萄孢菌基因組中。穩(wěn)定性試驗表明cry5Ba3Φ基因與潮霉素選擇基因一起整合至灰葡萄孢的基因組中，并且穩(wěn)定遺傳。

4、r>　　4． qRT-PCR結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因灰葡萄孢菌中cry5Ba3Φ基因的表達量是house-keeping基因actin的5.6±1.1倍。而cry5Ba3Φ基因在野生型灰葡萄孢菌中沒有表達。
　　5.生測實驗發(fā)現(xiàn)用轉(zhuǎn)cry5Ba3Φ基因灰葡萄孢菌飼喂松材線蟲，松材線蟲的繁殖總量為對照的48％-65%，死亡率為對照的1.7-2.5倍。
　　綜上所述，本研究明確了一個新的殺蟲晶體蛋白基因cry5Ba3對松材線蟲的毒殺活