一株雞傳染性貧血病毒強毒株的分離鑒定及其致病性和生物信息學分析.pdf

1、雞傳染性貧血?。–hicken infectious anemia,CIA）主要造成淋巴組織萎縮，雛雞再生障礙性貧血，骨髓脂肪化，皮膚和肌肉出血，導致免疫抑制，引起繼發(fā)感染或其它病原混合感染進而造成巨大損失。在世界主要的養(yǎng)禽國，雞貧血病毒(Chicken anemiavirus,CAV)已經(jīng)普遍流行，其給養(yǎng)禽業(yè)帶來的損失日益嚴重，已經(jīng)逐漸成為一個全球性問題。該病毒還是禽弱毒疫苗中常見的外源病毒污染物之一，為此我們人工模擬了使用CAV低劑

2、量污染的弱毒疫苗對SPF雞的影響。有報道稱CAV主要對雛雞具有較強的致病性，對日齡較大的雞危害則不明顯，本研究從某表現(xiàn)明顯貧血癥狀的日齡較大雞群中分離鑒定到一株CAV野毒株，通過系統(tǒng)的動物實驗觀察了該毒株不同感染劑量和不同感染日齡的致病性，并對其基因組進行了深入分析。
　　1、弱毒疫苗中CAV低劑量污染對SPF雞體重和疫苗免疫抗體的影響
　　為了觀察使用污染有低劑量CAV弱毒疫苗后對雞免疫和體重的影響，本試驗通過人工模擬試驗

3、觀察了CAV低劑量污染對SPF雞體重以及對NDV疫苗抗體產生的影響。結果顯示免疫接種污染10個EID50/羽和5個EID50/羽兩種劑量CAV的NDV疫苗后均造成了SPF雞體重顯著下降；并且NDV抗體水平與使用無污染疫苗組相比也顯著降低了。使用污染兩種劑量CAV的NDV疫苗后第2周開始均檢測到一定比例的CAV抗體陽性，而通過核酸檢測在使用污染疫苗后第1周就檢測到很高比例的CAV核酸陽性。研究結果不僅展示了弱毒疫苗中CAV污染對SPF雞生

4、產性能和免疫機能的影響，也提示我們在通過SPF雞檢查法檢測外源病毒污染時增加對病毒核酸檢測有助于節(jié)省檢測時間和提高檢出率。
　　2、CAV分離株對1日齡SPF雞的致病性
　　山東某種雞場部分2月齡雞生長遲緩，隨后個體差異逐漸變大，其臨床表現(xiàn)為雞冠、肉垂蒼白。病理剖檢的主要特征是小腿骨骨髓呈粉紅色甚至淡黃色，胸腺萎縮。原始病料經(jīng)接種雞胚后，提取DNA經(jīng)斑點雜交檢測為CAV陽性，證實成功分離到一株CAV野毒株，命名為CAV-SD

5、15株。將CAV-SD15株分別以150EID50,300EID50,700EID50,1500EID50四個劑量通過肌肉注射感染1日齡SPF雞，同時設置空白對照組研究其不同攻毒劑量下對1日齡SPF雞的致病性，每周對各組雞體重、血液指標、抗體水平及病毒血癥檢測，同時記錄死亡率，第三周時全部剖殺檢測免疫器官指數(shù)。試驗結果顯示，相對于空白對照組，不同劑量感染組均能夠引起顯著的生長遲緩和免疫抑制（p＜0.05），感染組的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)以

6、及NDV疫苗的抗體水平顯著降低（p＜0.05），但是150EID50和300EID50兩個攻毒劑量組之間部分結果差異不顯著。不同攻毒劑量下均能造成雞群一定的死亡率，1500EID50劑量攻毒組死亡率可達65％（7/20）。
　　3、CAV分離株對10周齡SPF雞的致病性
　　由于CAV一般只造成雛雞發(fā)病，但本毒株分離自2月齡發(fā)病雞，因此本研究針對10周齡的SPF雞進行攻毒試驗，觀察該分離株對大日齡SPF雞的致病性。將CAV-

7、SD15株以1500EID50的劑量肌肉注射10只10周齡SPF雞，同時設空白對照組。五周內每周對各組雞的體重、血液指標、抗體水平及病毒血癥檢測，在15周時所有雞只剖檢同時測定免疫器官指數(shù)。結果顯示，盡管感染組沒有發(fā)現(xiàn)雞發(fā)病死亡，但相對于空白對照組，感染組表現(xiàn)出了顯著的生長遲緩和免疫抑制（p＜0.05），免疫抑制的主要體現(xiàn)是感染組的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著降低以及AIV-H9疫苗的抗體水平顯著降低（p＜0.05）。感染組表現(xiàn)出了明顯的貧

8、血癥狀，剖檢可見骨髓嚴重黃化，紅細胞數(shù)目最低僅為空白對照組的50%左右，這表明該分離毒株對大日齡SPF雞也有明顯的致病性。
　　4、CAV分離株全基因組分析
　　經(jīng)過擴增測序得到CAV分離株的全基因組序列后，應用MEGA、BioEdit等生物信息學軟件對CAV-SD15分離株的遺傳進化關系以及編碼區(qū)氨基酸進行分析。結果顯示，SD15分離株與分離自臺灣的CAV18分離株同源性最高（98.9%），與分離自美國的NC001427株

9、同源性最低（93.9%）。遺傳進化樹可以發(fā)現(xiàn)所比對的34個分離株主要分為兩個分支，SD15株在第二個分支上，并且與CAV18臺灣株分布于同一個小支上，顯示了較近的親緣關系；SD15株有16個氨基酸位點與其他參考毒株有較大差異，其中有兩個氨基酸位點的突變是之前從未發(fā)現(xiàn)過的，分別為VP1蛋白210位的苯丙氨酸變異為絲氨酸，VP3蛋白25位的亮氨酸變?yōu)榻z氨酸。在VP3凋亡蛋白區(qū)域，SD15有兩個明顯的氨基酸突變且突變發(fā)生在弱凋亡誘導域內部，我