中國馬傳染性貧血病毒LTR啟動子活性及EIAV-,FDD-弱毒株生物學(xué)特性的研究.pdf

1、我國研制成功的馬傳染性貧血驢白細(xì)胞弱毒(equine infectious anemia virus donkey leukocyteattenuated,EIAVDLA)疫苗成功控制了馬傳染性貧血病在我國的流行.該疫苗具有良好的安全性和有效性,成為研究包括人艾滋病病毒在內(nèi)的慢病毒疫苗的良好自然動物模型.EIAV弱毒疫苗研制成功的路線是:將一株來源于馬體的EIAV強(qiáng)毒(遼毒株、EIAVL)經(jīng)過驢體連續(xù)傳代100余代使病毒毒力增強(qiáng)后獲得了

2、驢強(qiáng)毒株(EIAVD,對馬和驢90/致死率),然后將驢強(qiáng)毒株通過驢白細(xì)胞體外連續(xù)培養(yǎng)馴化120代,使病毒毒力喪失的同時(shí)保持了良好的免疫原性,最終培育成功了EIAV驢白細(xì)胞弱毒疫苗(EIAVDt<,DLA>).將驢白細(xì)胞弱毒疫苗進(jìn)一步通過驢胎皮膚細(xì)胞繼代,又獲得比驢白細(xì)胞弱毒疫苗免疫保護(hù)效果更好的驢胎皮膚細(xì)胞(fetal donkey dermal cells,FDD)弱毒疫苗. 前病毒DNA基因組兩端是長末端重復(fù)序列(LOng term

3、inal repeat,LTR),LTR含有控制病毒RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強(qiáng)予.LTR是基因組變異率最高的區(qū)域. 本研究對驢白細(xì)胞弱毒疫苗株(EIAVDtA)及其在驢胎皮膚細(xì)胞上傳代獲得的各代次驢胎皮膚細(xì)胞弱毒(第1-26代EIAVFDD)LTR進(jìn)行測序分析及LTR的啟動子功能比較.EIAV以準(zhǔn)種形式存在,EIAVDLA、EIAVFDD LTR存在多種類型,一些類型占主要優(yōu)勢.EIAV<,DLA>LTR按負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)(NRE)序列不

4、同可分為四種類型:NRE I型與強(qiáng)毒株NRE區(qū)長度相同但存在點(diǎn)突變現(xiàn)象,占EIAV<,DLA>LTR的1/3:NRE Ⅲ型的NRE有17nt插入、10nt缺失,占EIAV<,DLA>LTR的2/3,而只插入17nt的NRE Ⅱ型、只缺失10nt的NRE Ⅳ型每種類型只檢測到1個(gè)克隆.增強(qiáng)子區(qū)部分克隆有一段16nt的插入序列,其中包含1個(gè)Pu.1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn).EIAV<,DLA> LTR轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分為GGTC、AAAC、.AGA

5、C和GAAC等四種類型,在所測序的21個(gè)克隆中所占比例分別為23.8/、47.6/、14.3/和14.3/.強(qiáng)毒株的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為GGAC.啟動子活性比較實(shí)驗(yàn)說明負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)的插入序列對LTR的啟動子活性有一定抑制作用,增強(qiáng)子區(qū)插入序列對LTR的啟動子活性有一定增強(qiáng)作用,但均未達(dá)到顯著性差異.轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)對LTR啟動子活性大小的影響順序?yàn)?GGTC>AAAC>AGAC>GGAC,但差異不顯著.第13、26代EIAVF<,FDD> LTR的啟

6、動子活性在馬巨噬細(xì)胞和驢胎皮膚細(xì)胞中顯著高于EIAV<,DLE>、EIAVD LTR的啟動子活性,EIAVI<,D>LTR.的活性最低.疫苗培育過程中不同階段EIAV隨著病毒毒力的降低,LTR的啟動子活性逐漸增加.實(shí)驗(yàn)表明L,TR是EIAV細(xì)胞嗜性及毒力的影響因素之一. EIAV<,DLA>在驢胎皮膚細(xì)胞傳代過程中LTR.負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)也發(fā)生了明顯變異.第10代EIAV<,FDD>LTR開始出現(xiàn)lInt的插入序列(GATGACTAGC

7、T、):第13代插入序列發(fā)生突變(CCCTTATGACTAGCT),但不占主要優(yōu)勢,在第23代含有這段插入序列的LTR序列成為絕對優(yōu)勢的類型;第21代EIAV<,FDD> LTR 49nt后缺失了CTCTCA.第23代LTR序列的第24-63nt有10個(gè)A-G的突變,在第23、26代LTR序列中占主要優(yōu)勢.由于大量點(diǎn)突變的出現(xiàn),使第23代LTR的第54-68nt與第70-83nt形成不完全重復(fù).LTR的啟動子活性比較實(shí)驗(yàn)說明:隨著EIA

8、V<,DLA>在驢胎皮膚細(xì)胞中傳代次數(shù)的增加,EIAV<,FDD> LTR的啟動子活性逐漸增強(qiáng),但差異不顯著(P>0.05).病毒感染細(xì)胞提供Tat,LTR啟動子的激活活性是基礎(chǔ)活性的1.5-2.7倍.EIAV<,DLA> LTR啟動子活性在皮膚細(xì)胞中顯著低于EIAV<,FDD>LXR,P<0.01. 用PCR方法對第19、26代EIAV<,FDD>前病毒全基因進(jìn)行分段克隆與測序.對無免疫保護(hù)性的第19、26代EIAV<,FDD

9、>全基因序列與四個(gè)參考毒株比較分析發(fā)現(xiàn),gag只有1個(gè)氨基酸與四個(gè)參考毒株不同,但與國外毒株1369株相應(yīng)位置氨基酸相同;pol復(fù)制酶發(fā)生8處氨基酸變異,有3處氨基酸變異導(dǎo)致疏水性改變.env基因發(fā)生了多處穩(wěn)定性點(diǎn)突變,Env的gp90缺失了2個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn),主要中和決定區(qū)有1個(gè)氨基酸突變,但親水性沒有改變.gp45與EIAV<,FDD>疫苗株一樣有 TM 截短現(xiàn)象.S1 基因編碼的 Tat 蛋白氨基酸序列未發(fā)生變異.S2蛋白氨基