黃萎病菌致病相關(guān)基因VdMsb的功能研究及棉花幾丁質(zhì)相關(guān)基因家族的全基因組鑒定與功能分析.pdf

1、棉花（Gossypium spp.）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉纖維是紡織業(yè)原料的重要來(lái)源，同時(shí)棉籽也是重要的植物油脂資源。黃萎病菌（Verticillium wilt）是影響棉花生長(zhǎng)發(fā)育的最重要真菌病害，嚴(yán)重影響棉花纖維品質(zhì)和產(chǎn)量。棉花黃萎病菌致病機(jī)制及抗病基因的發(fā)掘與育種利用一直是棉花抗病遺傳育種研究的熱點(diǎn)。深入研究黃萎病菌中關(guān)鍵致病基因的功能特征，明確棉花抗病相關(guān)基因的作用機(jī)理，不僅為棉花與黃萎病菌互作機(jī)制的研究提供依據(jù)，而且可為棉

2、花抗病品種的培育提供重要的候選基因。
　　目前研究顯示，絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號(hào)在調(diào)節(jié)植物真菌菌絲生長(zhǎng)、在寄主植物表面的附著生長(zhǎng)、特殊的侵染結(jié)構(gòu)、分泌細(xì)胞壁降解酶等方面起重要作用。研究者們已經(jīng)從多種植物病原菌中成功鑒定出多個(gè)MAPK通路基因，其中包括位于MAPK信號(hào)通路上游的Msb2基因。該基因是一種典型的膜結(jié)合型粘蛋白，參與信號(hào)傳導(dǎo)并且位于絲狀生長(zhǎng)（F

3、ilamentous growth，F(xiàn)G）和高滲透壓調(diào)節(jié)（High osmolarity/glycerol pathway, HOG）信號(hào)途徑的上游，在植物病原菌侵染寄主植物過(guò)程中起著重要作用。而植物在抵抗真菌病害侵染過(guò)程中可通過(guò)感知病原菌相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）來(lái)激活復(fù)雜的免疫反應(yīng)，從而抵御病原菌的侵染。其中，病原真菌細(xì)胞壁的主要組成成分——幾丁質(zhì)就是一類

4、PAMPs。目前研究顯示，植物體內(nèi)存在著兩大類幾丁質(zhì)相關(guān)基因:幾丁質(zhì)受體蛋白與幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶通過(guò)降解真菌細(xì)胞壁釋放小分子幾丁寡糖，從而抑制真菌的生長(zhǎng)。而幾丁質(zhì)受體則可以特異性的識(shí)別上述幾丁寡糖，從而利用一系列的信號(hào)傳遞激活植物免疫反應(yīng)。因此，這兩類幾丁質(zhì)相關(guān)基因在植物免疫反應(yīng)中起著重要作用。
　　本研究以黃萎病菌落葉型菌株Vd8為材料，克隆了VdMsb基因并初步研究其功能;利用已釋放的棉花二倍體亞洲棉（A組）和雷蒙德氏棉（D組

5、）的基因組數(shù)據(jù)，進(jìn)行棉花幾丁質(zhì)相關(guān)基因家族的全基因組發(fā)掘、分類及功能分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用同源克隆的方法，從黃萎病菌Vd8中克隆到一個(gè)膜結(jié)合型粘蛋白基因VdMsb（GenBank登錄號(hào):KM032761）。該基因ORF全長(zhǎng)2688bp，編碼含895個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量和等電點(diǎn)分別為9.06 kD和4.33。生物信息學(xué)分析顯示，該基因的N-端包含一段由22個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，C-端包含一個(gè)由23個(gè)氨基酸殘基

6、組成的跨膜區(qū)域和一個(gè)由14個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的細(xì)胞質(zhì)尾體。通過(guò)對(duì)基因全長(zhǎng)進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因一共包含178個(gè)糖基化位點(diǎn)。蛋白序列比較發(fā)現(xiàn)，黃萎病菌VdMsb蛋白與尖孢鐮刀菌FoMsb2和稻瘟病菌MoMsb2的相似度達(dá)到了49.27％和48.78％。不同來(lái)源的VdMsb類同源基因在跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)尾體部分高度保守。
　　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法（Agrobacterium tumefaciens mediated

7、transformation，ATMT），成功獲得該基因的缺失及互補(bǔ)突變體。通過(guò)表型觀察發(fā)現(xiàn)，缺失突變體⊿msb的微菌核占整個(gè)菌落的比例顯著性下降，整個(gè)菌落呈現(xiàn)為白色。而互補(bǔ)突變體⊿msb+Msb相對(duì)于⊿msb突變體而言，表型恢復(fù)正常，與野生型Vd8表型相同。說(shuō)明VdMsb基因有無(wú)與黃萎病菌微菌核的形成顯著相關(guān)。對(duì)不同突變體及野生型進(jìn)行致病力分析發(fā)現(xiàn)，接種⊿msb突變體的棉花植株發(fā)病速度較為平緩，接種30天后平均病級(jí)指數(shù)為37.5％。相

8、對(duì)與野生型和互補(bǔ)突變體，致病力明顯下降。相似的結(jié)果也在接種擬南芥實(shí)驗(yàn)中重演。說(shuō)明VdMsb基因是黃萎病菌致病的關(guān)鍵基因。
　　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，野生型Vd8和⊿msb+ Msb突變體菌株樣品中孢子濃度無(wú)顯著性差異，分別為4.49±1.01×107和4.82±0.97×107個(gè)孢子。而⊿msb突變體菌株的產(chǎn)孢能力明顯下降，僅2.63±0.86×107個(gè)孢子。利用不同突變體及野生型菌株的孢子懸浮液處理擬南芥和棉花根部組織，以明確VdMs

9、b基因缺失突變體致病力下降的原因。通過(guò)電鏡掃描分析發(fā)現(xiàn)，缺失突變體⊿msb菌株在擬南芥根部附著的菌絲要明顯少于野生型Vd8和互補(bǔ)突變體⊿msb+Msb。黃萎病菌在棉花中侵入生長(zhǎng)分析發(fā)現(xiàn)，接種野生型Vd8和⊿msb+ Msb突變體菌株的棉花幼苗莖稈中出現(xiàn)了維管束褐化現(xiàn)象，說(shuō)明病原菌已經(jīng)進(jìn)入棉花維管束;而接種⊿msb突變體菌株的棉花幼苗莖稈無(wú)明顯變化。以上結(jié)果說(shuō)明，VdMsb基因與黃萎病菌的產(chǎn)孢能力、根部附著能力和侵入生長(zhǎng)能力緊密相關(guān)，是黃

10、萎病菌關(guān)鍵的致病基因。
　　2、利用二倍體雷蒙德氏棉及亞洲棉全基因組序列信息對(duì)棉花LysM基因家族成員進(jìn)行全基因預(yù)測(cè)。分別從A組和D組中獲得28和26個(gè)LysM基因。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域特征及聚類分析將上述基因分為L(zhǎng)YK、LYP、LysMe和LysMn四類。染色體定位表明，LysM基因家族成員分布在12條染色體上。根據(jù)其在染色體上的位置依次命名為GrYK1-GrL YK8、GrLYP1-GrLYP4、GrLysMe1-GrLysMe7和G

11、rLysMn1-GrLysMn7,并按照同源性對(duì)A組成員進(jìn)行命名。以棉花抗病品種海島棉Hai7124的根、莖和葉為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）共研究12個(gè)LysM基因在棉花不同組織器官中的表達(dá)特征。表達(dá)分析表明LysM類基因組織器官表達(dá)的多樣性。其中在根、莖和葉三種組織器官中都表達(dá)的基因有4個(gè):GbLYP1、GbLYP2、GbLysMn3和GbLysMn7。在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因有5個(gè):GbLYK1、GbLYK5、G

12、bLYK7、GbLysMe1和GbLysMe2。從表達(dá)水平分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因在根部表達(dá)量較高，分別是GbLYP1、GbLysMn7和Gb YK5。其中，GbLYP1和GbLYK5明顯受黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)，而GbysMn7在病菌處理后表達(dá)水平未發(fā)生顯著性變化。
　　通過(guò)同源克隆技術(shù)，成功從海島棉Hai7124中克隆了GbLYP1和GbLYK5基因。其中，GbLYP1基因ORF全長(zhǎng)1080bp，編碼359個(gè)氨基酸，分子量和等電點(diǎn)分別為

13、38.7kD和5.54Gb YK5基因ORF全長(zhǎng)2013bp，編碼670個(gè)氨基酸，分子量和等電點(diǎn)分別為73.7kD和5.90。
　　VIGS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射pTRV2-GbLYK5和pTRV2-GbLYP1的棉花幼苗真葉出現(xiàn)了嚴(yán)重的黃化、萎蔫和脫落等典型的黃萎病感病癥狀。病級(jí)指數(shù)分別達(dá)到了73％和66.7％，而對(duì)照組病級(jí)指數(shù)僅為35.4％。病級(jí)指數(shù)與目標(biāo)基因未沉默的對(duì)照相比，存在著極顯著的差異。說(shuō)明GbLYK5和GbLYP1基因

14、在棉花抗黃萎病過(guò)程中起重要作用。
　　3、利用二倍體雷蒙德氏棉及亞洲棉全基因組序列信息，從A組和D組中分別獲得49和46個(gè)幾丁質(zhì)酶基因。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)及進(jìn)化關(guān)系分為五類:ClassⅠ-Ⅴ。進(jìn)一步對(duì)來(lái)源于雷蒙德氏棉D(zhuǎn)基因組的幾丁質(zhì)酶基因家族成員進(jìn)行染色體定位，發(fā)現(xiàn)46個(gè)幾丁質(zhì)酶基因分布在12條染色體上。根據(jù)其在染色體上的位置依次命名為GrChi1-GrChi46，并按照同源性對(duì)A組成員進(jìn)行命名。
　　利用同源基因相似性原理，

15、以棉花抗病品種海島棉Hai7124的根、莖和葉為材料，研究了37個(gè)幾丁質(zhì)酶基因在棉花不同組織器官中的表達(dá)特征。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，Chi類基因組織器官表達(dá)的多樣性。其中在根、莖和葉三種組織器官中都2個(gè)，GbChi31和GbChi46。在根部?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)的基因有21個(gè)，其中GbChi3和GbChi22兩個(gè)基因的表達(dá)量最高。有7個(gè)基因在莖部?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)，其余9個(gè)基因在葉中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GbChi3、GbChi22、GbChi31和G

16、bChi46四個(gè)基因受黃萎病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著提高，其中GbChi22受黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)量最高。
　　通過(guò)同源克隆技術(shù)，成功從海島棉Hai7124中克隆了GbChi22，該基因ORF全長(zhǎng)1107bp，編碼368個(gè)氨基酸，分子量和等電點(diǎn)分別為93.6kD和5.04。其N端有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)(SP)，一個(gè)Glyco_hydro_18結(jié)構(gòu)域，基因組序列中包含一個(gè)內(nèi)含子。
　　利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，對(duì)GbChi22基因進(jìn)行功能分析。