納米氧化銅和硫酸銅對豬SIEC細(xì)胞銅代謝酶影響的比較研究.pdf

1、銅是生物機(jī)體生命活動的必需元素，畜牧生產(chǎn)中由于高銅有促生長和抗菌等作用，刺激了養(yǎng)殖戶盲目的添加高銅，劑量控制不好就會導(dǎo)致動物機(jī)體中毒，同時大量沒有被機(jī)體吸收的銅排出體外造成環(huán)境污染。納米氧化銅由于尺寸小、活性高、易被動物機(jī)體吸收等特點成為一種可行性的銅源。本試驗通過SIEC細(xì)胞的培養(yǎng)，比較研究納米氧化銅和硫酸銅對細(xì)胞銅相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，對納米氧化銅的代謝規(guī)律及其代替硫酸銅作為豬飼料銅源的可能性進(jìn)行了探討。
　　 將凍存的SIE

2、C細(xì)胞解凍后常規(guī)培養(yǎng)，采用第5-8代細(xì)胞進(jìn)行試驗。培養(yǎng)的細(xì)胞分為正常對照組、硫酸銅組、納米氧化銅組。硫酸銅組細(xì)胞培養(yǎng)液當(dāng)中分別添加相同體積不同劑量的CuSO4·5H2O使其終濃度分別為5、10、20、40μg/mL CuSO4，納米氧化銅組細(xì)胞培養(yǎng)液當(dāng)中分別添加相同體積不同劑量的納米氧化銅使其終濃度分別為5、10、20、40μg/mL。銅處理后細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h，采樣，ELISA方法測定MT含量，比色法檢測細(xì)胞CuZn-SOD活性，熒光

3、定量PCR檢測MT、CTR1、ATOX1、CuZn-SOD、COX17基因的表達(dá)量。細(xì)胞活性的檢測在銅處理細(xì)胞12h、24h、36h、48h、60h各個不同的時間段用MTT法檢測。
　　 腸上皮細(xì)胞為形狀不規(guī)則的單層柱狀上皮細(xì)胞。MTT試驗中銅處理細(xì)胞后，細(xì)胞生長表現(xiàn)出不同程度的抑制，其中10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL硫酸銅組影響更明顯。40μg/mL納米氧化銅和5μg/mL硫酸銅組可以顯著提高CuZn-SOD活

4、性(P＜0.05)，但是40μg/mL硫酸銅組比同劑量的納米氧化銅組和對照組活性降低(P＜0.05)。與對照組相比，納米氧化銅可以促進(jìn)MT含量的升高(P＜0.05)，與同劑量的硫酸銅組相比，10、20、40μg/mL納米氧化銅組MT含量明顯升高(P＜0.05)。與對照組相比，10、20、40μg/mL納米氧化銅和硫酸銅劑量組對CTR1基因的表達(dá)表現(xiàn)出抑制作用(P＜0.05)，同劑量（10、20、40μg/mL）時添加納米氧化銅比硫酸銅對

5、腸上皮細(xì)胞CTR1基因抑制作用更明顯(P＜0.01)。20、40μg/mL硫酸銅組和40μg/mL納米氧化銅組金屬硫蛋白基因的表達(dá)量較對照組升高(P＜0.05)，其中10μg/mL的納米氧化銅組促進(jìn)作用更明顯(P＜0.01)。10μg/mL、20μg/mL、40μ g/mL納米氧化銅組CuZn-SOD基因的表達(dá)量比對照組和同劑量的硫酸銅組顯著降低(P＜0.05);納米氧化銅和硫酸銅可以抑制ATOX1基因的轉(zhuǎn)錄(P＜0.01)，兩試驗組中

6、，5μg/mL銅添加劑量時硫酸銅組ATOX1基因表達(dá)量較低(P＜0.01)。添加納米氧化銅和硫酸銅對腸上皮細(xì)胞COX17基因表達(dá)量沒有顯著影響(P＞0.05)。
　　 硫酸銅在培養(yǎng)基中以銅離子形式存在，離子形式的銅進(jìn)入豬腸上皮細(xì)胞主要是經(jīng)CTR1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的攜帶。與硫酸銅相比，納米氧化銅在培養(yǎng)基中除了以離子形式存在外，還以納米粒子的形式存在，由于納米粒子的活性高可以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的依賴性較低導(dǎo)致豬腸上皮細(xì)胞基底側(cè)的

7、CTR1蛋白轉(zhuǎn)錄水平降低。進(jìn)入腸上皮細(xì)胞后的銅一條途徑是與MT結(jié)合形成螯合物，由于納米氧化銅以兩種途徑進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致銅流失減少，細(xì)胞內(nèi)銅含量比硫酸銅組高，引起MT轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量升高。進(jìn)入細(xì)胞的銅需要適量的抗氧化酶拮抗銅對細(xì)胞的氧化作用，與硫酸銅組相比，納米氧化銅組更能有效地激活細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，表現(xiàn)為:進(jìn)入細(xì)胞的銅除提高細(xì)胞中CuZn-SOD的活性外，在5μg/mL時通過促進(jìn)ATOX1表達(dá)，促進(jìn)銅離子代謝出細(xì)胞;在10、20、40μ