甘蔗斑茅雜交后代育性相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、甘蔗（Saccharum L.）不僅是世界上最重要的糖料作物，還是重要的能源作物之一。斑茅作為一種優(yōu)良的種質(zhì)資源，在甘蔗品種選育中具有重要利用價(jià)值。斑茅與甘蔗雜交后代常表現(xiàn)育性低或不育，這對(duì)甘蔗雜交育種產(chǎn)生了消極影響。但雜交后代間育性有分離，因而對(duì)育性差異基因進(jìn)行深入研究是很有必要。育性相關(guān)基因研究為解釋這種現(xiàn)象提供理論依據(jù)和基因儲(chǔ)備。本研究基于鄧祖湖等以花粉育性有差異的斑茅雜種BC1及其親本為材料進(jìn)行的基因芯片雜交結(jié)果，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)

2、，克隆了幾個(gè)芯片中穩(wěn)定表達(dá)的差異基因，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了初步分析。主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1.基于芯片，課題組前期克隆了ScMADS1基因，通過同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因與水稻SVP基因相似性達(dá)83%，qRT-PCR結(jié)果表明該基因與水稻SVP的表達(dá)模式一致，在營(yíng)養(yǎng)組織和花穗中都有表達(dá)；而且，ScMADS1在三套育性差異材料中均呈現(xiàn)在可育材料中高表達(dá)；這暗示ScMADS1可能在甘蔗育性方面起作用。為了探索ScMADS1與其他MADS-box

3、基因的調(diào)控關(guān)系，克隆了甘蔗 MADS-box各功能家族的代表基因cDNA片段——ScLHS,ScAP1, ScAG2, ScPI。然后以育性有差異的、不同發(fā)育時(shí)期的甘蔗花穗為材料通過qRT-PCR分析相對(duì)表達(dá)量，并結(jié)合擬南芥中基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，推測(cè)了甘蔗中ScAP1、ScAG2、ScPI、ScLHS和 ScMADS1之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)還構(gòu)建了pCAMBIA-MADS1過量表達(dá)載體，為該基因功能的驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。
　　2.根

4、據(jù)芯片和相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)SR基因，作為一種重要剪接因子，在花的發(fā)育以及植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的作用。實(shí)驗(yàn)克隆了3個(gè)絲氨酸精氨酸豐富蛋白（SR）基因——ScSCL25,ScSCL30和ScRS31。ScSCL25 cDNA序列全長(zhǎng)為963bp，編碼209個(gè)氨基酸；gDNA序列全長(zhǎng)為2966bp，包括五個(gè)內(nèi)含子。ScSCL30的cDNA序列全長(zhǎng)為867bp，編碼264個(gè)氨基酸，可能有6個(gè)大的內(nèi)含子。序列分析表明這兩個(gè)基因同屬于SC35-lik

5、e亞家族，均編碼不穩(wěn)定的親水蛋白。將ScSCL30基因與高粱的gDNA比對(duì)發(fā)現(xiàn)其共線性在5′端中斷，推測(cè)在此處可能產(chǎn)生了一個(gè)倒位。ScRS31屬于 RS亞家族，cDNA序列長(zhǎng)1120bp，具有 polyA結(jié)構(gòu)，編碼蛋白包含兩個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RRM）?；蚪Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該基因gDNA序列長(zhǎng)約5000bp，包含15個(gè)大的內(nèi)含子。
　　實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)表明 ScRS31在甘蔗芽、花和根中特異性表達(dá)，推測(cè)該基因參與花和根的發(fā)育。與 Sc

6、RS31相似，ScSCL30也在花、第一節(jié)間和芽中表達(dá)量比較高。兩種 SR蛋白均在花中有較高的表達(dá)量，暗示兩者可能存在互作，且在花的發(fā)育中起作用。此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)ScSCL30與ScRS31表達(dá)量與甘蔗材料的育性沒有呈現(xiàn)一定的規(guī)律。
　　3.根據(jù)基因芯片，還克隆了一個(gè)茉莉酸激素誘導(dǎo)蛋白基因ScJIP32，氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因與木菠蘿素家族凝集素(Jacalin-related lectin)同源性很高，包含兩個(gè)功能區(qū)：一個(gè)疾病

7、響應(yīng)結(jié)構(gòu)域（dirigent domain）和一個(gè)木菠蘿素家族凝集素相關(guān)凝集素結(jié)構(gòu)域（jacalin domain）。研究發(fā)現(xiàn) ScJIP32受茉莉酸誘導(dǎo)后表達(dá)量迅速下降；鹽脅迫處理也能使該基因表達(dá)量下降，而且原核鹽脅迫實(shí)驗(yàn)再次證明了該基因在鹽脅迫中起到積極的作用。ScJIP32基因在第一節(jié)間表達(dá)量最高，其次是根、芽和花穗，在葉片和其他節(jié)間基本不表達(dá)。而在不同育性材料中，該基因的表達(dá)量與育性沒有呈現(xiàn)一致性的規(guī)律。
　　構(gòu)建了pET

8、-JIP32原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中表達(dá)出融合蛋白，并用Ni柱純化出目的蛋白，為該基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。此外，還構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCAMBIA-JIP32，為轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證該基因功能提供了基礎(chǔ)。
　　簡(jiǎn)單概括，篩選到ScMADS1基因?yàn)橛躁P(guān)鍵基因，該類基因在花的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。而調(diào)控因子SR類基因在甘蔗的生長(zhǎng)點(diǎn)表達(dá)量高，可能參與細(xì)胞分裂，與植株的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。茉莉酸誘導(dǎo)蛋白基因ScJIP32，受到茉莉酸和