斑節(jié)對蝦TLR22及Relish基因的克隆與表達分析.pdf

1、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟品種。近年來,疾病爆發(fā)、種質(zhì)資源退化和養(yǎng)殖環(huán)境污染導(dǎo)致對蝦在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)高死亡率,造成了巨大經(jīng)濟損失,成為制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的瓶頸之一。因此,從斑節(jié)對蝦免疫系統(tǒng)入手,發(fā)掘和分析免疫相關(guān)的基因,研究其免疫調(diào)控規(guī)律,探討其抗病機理,提高蝦體抗病能力,并為進一步篩選抗病基因,從基因水平進行品種改良提供理論依據(jù)。本研究克隆了免疫信號通路的關(guān)鍵因子—TLR22基因和Re

2、lish基因,并探索其表達調(diào)控機制。同時,本實驗還對 Relish基因在斑節(jié)對蝦發(fā)育過程中的作用進行了初步研究。
　　TLR22是 Toll樣受體家族中重要的一員。Toll樣受體的發(fā)現(xiàn)是20世紀(jì)以來宿主天然免疫系統(tǒng)的最大進展。Toll屬于模式識別受體(PRR),通過胞外區(qū)的LRR結(jié)構(gòu)域特異性識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP),啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)干擾

3、素、炎癥因子等抗炎癥因子表達。獲得斑節(jié)對蝦 TLR22(以下簡稱 PmTLR22)基因為3680bp,包含3045bp的ORF,可編碼1014個氨基酸。PmTLR22蛋白由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成。其胞外區(qū)含有12個亮氨酸重復(fù)(LRRs),胞內(nèi)具有相對保守的Toll/白介素1受體結(jié)構(gòu)域(Toll/IL-1R，TIR)。PmTLR22胞外的LRRs在第4個亮氨酸殘基(L)高度保守。TLR22在進化上更趨于TLR3。實時定量熒光 P

4、CR顯示在所檢測的11種組織中,PmTLR22的mRNA在肝胰腺的表達最高,其次為腸、胃。使用定量PCR檢測肝胰腺 PmTLR22在不同免疫刺激條件下的mRNA表達情況,結(jié)果顯示肝胰腺 TLR22可被白斑綜合征病毒(WSSV)和創(chuàng)傷弧菌誘導(dǎo)表達,而金黃色葡萄球菌不能誘導(dǎo)該基因表達。其中 WSSV感染24h,PmTLR22顯著上調(diào)表達23倍,創(chuàng)傷弧菌感染后6h和9h顯著上調(diào) PmTLR22表達。進一步,證明了病毒核酸類似物 Poly(I:

5、C)及 R484均可激活 PmTLR22的表達,說明病毒 PAMP對 PmTLR22具有誘導(dǎo)表達作用,PmTLR22可能是識別 PAMP的模式識別分子。獲得 PmTLR22胞外段的重組融合蛋白,其大小約為58kDa,為進一步研究其功能提供基礎(chǔ)。
　　Relish是 NF-κB家族成員之一。Rel/NF-κB是大部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞,調(diào)控機體的先天性免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞增殖和分化、細胞凋亡等重要的病理和生理過程。本研究在構(gòu)建的斑節(jié)

6、對蝦肝胰腺 cDNA文庫中克隆得到 NF-κB的家族成員之一 Relish,命名 PmRelish,其全長5112bp,包括3561bp的ORF,推測編碼一個含1186個氨基酸的蛋白。PmRelish的蛋白具有Rel/NF-κB蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)特征,包括 N端的RHD結(jié)構(gòu)域,核定位信號,C端的6個錨蛋白重復(fù)序列以及死亡結(jié)構(gòu)域,表明該蛋白是 NF-κB1亞型。同源性分析顯示斑節(jié)對蝦PmRelish與凡納濱對蝦 LvRelish及短小亞型

7、 LvRelish-S的RHD結(jié)構(gòu)域序列完全一致,進化上也與之關(guān)系最近。該基因在所檢測組織中組成型表達,并在血細胞表達量最高。使用定量 PCR檢測肝胰腺 PmRelish在不同免疫刺激條件下的mRNA表達情況,結(jié)果顯示肝胰腺 Relish基因是誘導(dǎo)型表達,并被創(chuàng)傷弧菌、金黃色葡萄球菌和WSSV調(diào)控表達,其中被創(chuàng)傷弧菌上調(diào)表達最顯著。進一步,證明了病毒核酸類似物 Poly(I:C)及 R484可激活 PmRelish的表達。上述研究說明

8、Relish是斑節(jié)對蝦的重要免疫因子,可能通過直接或間接作用參與對細菌和病毒的免疫反應(yīng)。此外,研究了 PmRelish在斑節(jié)對蝦的發(fā)育過程中的表達情況。結(jié)果顯示 PmRelish表達在幼體發(fā)育四個時期都存在顯著性差異,其中糠蝦階段表達量最高;PmRelish在不同發(fā)育階段的精巢和卵巢中的表達特征相似,即未成熟期的表達相對較低,其中 PmRelish在10-12cm體長雄蝦精巢中表達量最高,卵巢中的表達則在成熟期(V期)最高,為卵原細胞期