腸球菌屬細菌素的篩選及其結構基因的表達.pdf

1、腸球菌屬于乳酸菌，是人和動物腸道及部分食品的重要微生物菌群，它能夠產(chǎn)生稱為腸球菌素的抗菌肽。由于腸球菌產(chǎn)生的細菌素不僅能夠抑制與其相關的菌群還能夠抑制革蘭氏陽性致病菌和食源致病菌，因此，它們有望應用在動物飼料添加劑和天然食品保鮮劑中。本研究擬從我室分離保存的具有益生特性的腸球菌中，進一步篩選產(chǎn)細菌素的細菌素菌株，并對其細菌素抑菌特性研究，為開發(fā)新型微生態(tài)制劑提供理論依據(jù)。
　　 通過對屎腸球菌HDRsEf1抑菌譜的測定確定金黃色

2、葡萄球菌作為指示菌。瓊脂覆蓋試驗顯示，11株試驗菌株中有5株菌腸球菌有明顯的抑菌效果，結合PCR技術對常見的腸球菌素基因進行檢測，最終篩選出兩株產(chǎn)EnterocinL50的腸球菌分別為屎腸球菌Wsg09和糞腸球菌T-12。產(chǎn)細菌素腸球菌的生長曲線、pH和抑菌圈曲線顯示，菌株生長迅速，產(chǎn)酸，培養(yǎng)30h時細菌素活性達到最大。
　　 從產(chǎn)細菌素菌株的野生質粒上成功擴增到了entL50基因，證明該細菌素是由質粒DNA編碼，并將擴增產(chǎn)物連

3、接到pMD18-T載體上，構建克隆質粒pMD-L50測序分析，與登錄號FJ618564.1的基因序列同源性達到100％。運用生物信息學方法分析了蛋白相關特性和結構的預測，EnterocinL50是由A和B兩個小肽組成，均具有與靶細胞膜互作的重要特征即呈陽離子特性，有高度的α螺旋結構。
　　 為促進足量的EnterocinL50產(chǎn)生和便于其純化，我們選用大腸桿菌異源表達系統(tǒng)進行重組蛋白的大量表達。將兩個重組原核表達質粒pET28a

4、-L50A和pET28a-L50B分別轉入大腸桿菌BL21中，并在大腸桿菌中成功表達。SDS-PAGE分析顯示，重組蛋白His-Ent.L50A及在分子伴侶作用下誘導產(chǎn)生的His-Ent.L50B均為可溶性。利用親和層析從細胞裂解產(chǎn)物上清中純化His-Ent.L50A和His-Ent.L50B。純化產(chǎn)物抑菌活性檢測結果顯示His-Ent.L50A和B具有協(xié)同作用，對單增李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，MIC和MBC結果證明His-