糞腸球菌esp基因克隆、原核表達(dá)及其蛋白初步研究.pdf

1、目的:
　　 構(gòu)建內(nèi)蒙古鵝源糞腸球菌分離菌株，表面蛋白esp基因的原核表達(dá)載體，并在BL21大腸桿菌中表達(dá)。對(duì)所表達(dá)的目的蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性以及其蛋白的初步應(yīng)用進(jìn)行研究。
　　 方法:
　　 構(gòu)建分離菌株esp基因的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)并純化蛋白后對(duì)所純化的目的蛋白進(jìn)行初步分析:對(duì)糞腸球菌分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)株的DNA總基因組進(jìn)行提取。依據(jù)Genebank中公布的esp基因堿基序列，應(yīng)用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟

2、件，設(shè)計(jì)一對(duì)esp基因特異性引物。經(jīng)PCR擴(kuò)增分離菌株esp基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后膠回收并純化目的片斷。將目的片斷與pMD18-TVector克隆載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)pMD18T-esp重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，單、雙酶切，測序鑒定。構(gòu)建pET28a-esp重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞中。將pET28a-esp/BL21經(jīng)過IPTG最佳濃度誘導(dǎo)，通過蛋白電泳SDS-PAGE鑒定正確后，用鎳柱純化，得到純化

3、的Esp目的蛋白。將制備的糞腸球菌全菌體超聲裂解滅活菌苗和Esp目的蛋白分別免疫家兔，獲得全菌體和目的蛋白的抗血清，通過Western-Blot方法檢測目的蛋白的免疫原性和間接ELISA方法檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍椎姆磻?yīng)原性。
　　 結(jié)果:
　　 1.構(gòu)建的重組質(zhì)粒由單、雙酶切，PCR擴(kuò)增和測序鑒定正確后，表明成功的克隆了糞腸球菌esp基因的堿基序列，并且證明克隆片段閱讀框架正確，重組質(zhì)粒的克隆載體構(gòu)建成功。
　　 2.成功

4、構(gòu)建pET28a-esp/BL21，在pET28a(+)系統(tǒng)中成功表達(dá)了Esp融合蛋白，獲得小量純化的Esp重組目的蛋白。經(jīng)Western-blot及間接ELISA方法，證實(shí)了重組蛋白的免疫原性及反應(yīng)原性。
　　 結(jié)論:
　　 1.實(shí)驗(yàn)表明糞腸球菌esp堿基序列克隆成功，該堿基序列長498bp編碼166個(gè)氨基酸。
　　 2.在pET28a系統(tǒng)中成功表達(dá)了Esp融合蛋白并小量純化，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性及臨床診斷