家蠶來源腸球菌的RAPD分型及類腸球菌素的分離純化.pdf

1、腸球菌是家蠶消化道中的一種正常菌群。它直接參與了宿主的多種生理代謝活動，是宿主正常生理活動不可缺少的重要組成部分。 同時腸球菌也是一種潛在性致病菌，健康家蠶對其具有足夠的預防能力，只有在宿主體質(zhì)虛弱或環(huán)境不良的情況下才會發(fā)揮致病作用，是引起家蠶細菌性腸道病的病原細菌，因此探討該菌叢的生物學特性及生態(tài)變化，對了解家蠶細菌性腸道病致病機理和腸球菌與其它病原微生物互作等方面都具有重要意義。 傳統(tǒng)的數(shù)值分類學的鑒定方法，工作量大

2、、時間長。隨機擴增DNA多態(tài)性分析(RAPD)技術(shù)是分子生物學中重要的研究手段之一。它能在DNA水平反映不同樣本之間的差別。本試驗通過優(yōu)化Mg2+濃度、DNA模板加入量、引物濃度、TaqDNA聚合酶加入量、PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)等建立了家蠶來源腸球菌的RAPD-PCR反應(yīng)體系，并對從家蠶消化道中分離的表現(xiàn)為生理生化特性多樣性的14個腸球菌分離菌株和3個標準菌株進行了DNA多態(tài)性研究。確定了家蠶來源腸球菌RAPD分析的反應(yīng)體系：擴增反應(yīng)總體積

3、25μL，反應(yīng)液中含模板DNA為50ng；Mg2+3.5mmol/L；dNTPs200mmol/L；TaqDNA聚合酶3U；引物濃度15pmol/L；PCR擴增程序為：94℃預變性3min，94℃變性40s，35℃退火40s，72℃延伸1min，45次循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10min，然后4℃保存。應(yīng)用篩選的8條隨機引物，共擴增出625個位點，其中99.7％為多態(tài)性位點，表明供試菌株具有豐富的DNA多態(tài)性。對擴增結(jié)果進行聚類分析，

4、供試菌株分為Entfaecium、Ent.casseliflavus、Ent.avium、Entfaecalis4個類群。本試驗RAPD分型結(jié)果與前期數(shù)值鑒定結(jié)果基本一致。 本研究室前期研究結(jié)果表明，家蠶來源腸球菌外分泌蛋白具有抑制N.b發(fā)芽的作用。本試驗以家蠶來源腸球菌(EntfaecalisZJU)和家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis，簡稱N.b)為材料，篩選了一種適合EfZJU生長和外分泌蛋白含量高的培養(yǎng)基，并對抑

5、制微孢子蟲發(fā)芽的菌外分泌蛋白進行了初步的分離純化，以期為利用腸球菌開展蠶病的微生態(tài)防治提供參考。 培養(yǎng)基的篩選試驗表明，進口MRS(-G)培養(yǎng)基所得透析液的底色較淺，對用分光光度法測定微孢子蟲的發(fā)芽抑制率影響最小。吐溫添加量控制在5-10g/L，在37℃150r/min條件下培養(yǎng)30h時EfZJU的生長情況最好，細菌繁殖達到最高峰，以后隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中養(yǎng)分逐漸消耗，細菌處在對數(shù)生長曲線后期，細菌數(shù)目逐漸減少。用Bra

6、dford法測得其蛋白含量最大可達3.32mg/mL，對家蠶微孢子的發(fā)芽抑制率在72.0％。 蛋白分離純化試驗結(jié)果表明，將蛋白粗提液過SephadexG-75柱，收集其3個吸收峰，用PEG包埋法濃縮后進行微孢子蟲發(fā)芽抑制試驗。結(jié)果峰Ⅰ、Ⅱ?qū)ξ㈡咦拥陌l(fā)芽相對抑制率在20.5％，峰Ⅲ的相對抑制率在59.0％,說明活性物質(zhì)主要存在于峰Ⅲ中。 SDS-PAGE電泳結(jié)果表明峰Ⅰ、Ⅱ沒有蛋白條帶，峰Ⅲ有三條主要的蛋白帶，分子量在50