糞類圓線蟲兩個不同發(fā)育階段microRNA轉(zhuǎn)錄組的鑒定.pdf

1、microRNA(miRNAs)是一類長度在18-24nt的非編碼RNA。miRNA能通過與編碼蛋白的mRNA互補或者部分互補從而抑制mRNA的翻譯，對生物起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控涉及細(xì)胞分化凋亡、生長發(fā)育和基因表達(dá)等多種重要的生物學(xué)過程，而且在病毒、植物和動物中廣泛的存在。盡管第一個miRNA(lin-4)在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，其后在其他生物中也相繼發(fā)現(xiàn)了幾百個miRNAs，其中部分miRNAs的功能也逐漸被闡述，但是目前關(guān)

2、于寄生蟲miRNAs鑒定和分子機(jī)制的研究的報道卻很少。寄生蟲生活史復(fù)雜，有的寄生蟲從幼蟲發(fā)育至成蟲甚至要改變多個宿主，這樣就需要蟲體快速地適應(yīng)環(huán)境的變化。而具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的miRNAs很可能在寄生蟲的生命活動起著重要的調(diào)節(jié)作用。糞類圓線蟲是一種重要的人畜共患寄生線蟲，與大多數(shù)寄生線蟲不同，它的生活史包括寄生世代和自由生活世代，因此被認(rèn)為是很好的研究寄生生活的模式動物，但目前尚未見到有關(guān)該寄生線蟲miRNAs研究的報道。
　　

3、 本研究通過對糞類圓線蟲的寄生后自由生活一期幼蟲和具有感染能力的三期幼蟲建立miRNA文庫進(jìn)行高通量測序，鑒定參與糞類圓線蟲這兩個不同發(fā)育時期的miRNAs并研究其差異表達(dá)。同時通過生物信息學(xué)方法對兩個不同時期的總miRNAs進(jìn)行靶點的預(yù)測。最后，鑒于目前寄生蟲中的miRNAs研究較少，選取保守miRNAs利用分子生物學(xué)方法分析其在糞類圓線蟲兩個不同發(fā)育時期的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示:
　　 1)糞類圓線蟲兩個不同時期幼蟲文庫的建立和

4、高通量測序建立了糞類圓線蟲兩個不同發(fā)育時期幼蟲的文庫。高通量測序后，分別在糞類圓線蟲的自由生活一期幼蟲中獲得了11，154，540 clean reads和1，570，666 uniquereads，具有感染能力的三期蟲體中獲得了11，571，267 clean reads和707，106 uniquereads。
　　 2) miRNAs數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析兩個文庫中的小RNA分布主要集中在20-24nt;對小RNA數(shù)據(jù)處理后

5、，糞類圓線蟲兩個時期中共獲得15個保守miRNAs共17個miRNA前體、110個新miRNAs和113個潛在的miRNAs。在新miRNAs中，自由生活一期幼蟲有3個特異表達(dá)的新miRNA;
　　 靶基因預(yù)測軟件PicTar對所有的miRNAs預(yù)測共得到234個靶基因，通過GO分析發(fā)現(xiàn)這31個靶基因功能主要集中在連接、酶促和運輸;生物學(xué)過程分類集中在細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程和刺激反饋。比較分析發(fā)現(xiàn):參與生物學(xué)調(diào)節(jié)、定位和色

6、素沉積生物學(xué)過程的靶基因僅僅在具有感染能力的三期幼蟲miRNAs中被預(yù)測，而與生命發(fā)展和死亡相關(guān)的預(yù)測靶基因只在寄生后自由生活一起幼蟲的miRNAs中發(fā)現(xiàn)。
　　 通過對miRBase收錄的物種的所有miRNAs分析顯示，在糞類圓線蟲中發(fā)現(xiàn)的15個保守miRNAs中miR-50、miR-72、miR-86、miR-236和miR-360僅僅在線蟲中發(fā)現(xiàn)。miR-71、miR-79和miR-252在多個物種中發(fā)現(xiàn)，而miR-92、

7、miR-124和miR-137基本上存在于miRBase收錄的所有物種中。
　　 3)分子生物學(xué)方法驗證糞類圓線蟲中的miRNAs通過stemloop-PCR的方法在糞類圓線蟲三期幼蟲中克隆、測序了4個高度表達(dá)的保守miRNAs，測序結(jié)果顯示在這4個miRNAs存在三期幼蟲中。選取1個潛在的miRNA(Let-7)和3個保守miRNAs進(jìn)行熒光定量PCR確定這些miRNAs在糞類圓線蟲中兩個不同時期幼蟲中的相對表達(dá)情況，熒光定量