日本血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體差異表達(dá)基因解析.pdf

1、血吸蟲病人獸共患，分布廣泛，危害嚴(yán)重。上世紀(jì)90年代，巴西、中國的的科學(xué)家分別在曼氏血吸蟲和日本血吸蟲的基因組測序及注釋方面取得重要進(jìn)展，獲得大量有關(guān)血吸蟲基因組一般生物學(xué)意義的大量信息。 本研究則針對血吸蟲生活史復(fù)雜，其生長發(fā)育過程中蟲體呈現(xiàn)顯著的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)變化的特點，以在我國流行的日本血吸蟲為對象，利用大規(guī)模、高通量的基因分離分析技術(shù)，開展了不同發(fā)育階段蟲體差異表達(dá)基因分離、鑒定和解析研究，為從分子水平闡明血吸蟲生長發(fā)育

2、及其與宿主相互作用的機(jī)制建立重要基礎(chǔ)，為疫苗和藥物研究開拓新途徑。主要研究結(jié)果概述如下： 一、日本血吸蟲7d童蟲消減cDNA文庫的構(gòu)建及測序分析利用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)，以日本血吸蟲7天童蟲為實驗組，42天成蟲為驅(qū)動組，首次構(gòu)建了日本血吸蟲早期童蟲期別差異表達(dá)消減cDNA文庫。獲得的文庫重組率為90％，大部分cDNA插入片段在500bp左右。從文庫中選取6000個克隆測序，得到5474個ESTs信息，EST大小大多在30

3、0-900bp之間，平均長度為571bp。使用在線的PHRED工具對EST進(jìn)行拼接，得到1764條clusters，包含456個contigs和1306個singletons。所得的Clusters數(shù)量約占日本血吸蟲基因組的11～8.8％(預(yù)計血吸蟲表達(dá)基因為15000～20000個)。 二、日本血吸蟲不同發(fā)育階段差異表達(dá)基因研究為分析日本血吸蟲不同發(fā)育階段差異表達(dá)基因狀況，將5000個日本血吸蟲cDNA克隆(4000個來自7d

4、童蟲消減cDNA文庫的克隆和1000個來自尾蚴、雌雄蟲、成蟲和蟲卵消減cDNA文庫的克隆)定制cDNA芯片，每個克隆在芯片上重復(fù)點樣3次。以7d蟲體cDNA為對照，分別和日本血吸蟲6個不同發(fā)育階段(7d，13d，18d，23d，32d，42d)和42d雌蟲、42d雄蟲cDNA進(jìn)行雙通道雜交，每個階段的樣本做3次生物學(xué)重復(fù)。對每個基因雜交得到的9個雜交信號值(ratio值)用SAM軟件進(jìn)行分析，假陽性率(FDR)控制在5％以內(nèi)，再以2倍標(biāo)

5、準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。7d蟲體樣本的自身雜交結(jié)果說明芯片平臺可靠。再選擇18個芯片雜交顯示差異表達(dá)基因進(jìn)行realtimePCR驗證，結(jié)果和芯片結(jié)果基本相符。 芯片雜交結(jié)果歸納如下： 1.發(fā)現(xiàn)了一批不同發(fā)育階段差異表達(dá)的基因。芯片雜交結(jié)果顯示，和7d蟲體相比，13d蟲體差異表達(dá)克隆有34個，代表22個基因，其中上調(diào)基因4個，下調(diào)基因18個，未知基因2個；18d蟲體差異表達(dá)克隆有238個，代表123個基因，其中上調(diào)基因86個

6、，下調(diào)基因37個，未知基因9個；23d蟲體差異表達(dá)克隆有244個，代表136個基因，其中上調(diào)基因47個，下調(diào)基因89個，未知基因7個；32d蟲體差異表達(dá)克隆有186個，代表99個基因，其中上調(diào)基因46個，下調(diào)基因53個，未知基因7個；42d蟲體差異表達(dá)克隆有158個，代表95個基因，其中上調(diào)基因54個，下調(diào)基因41個，未知基因4個；42d雌蟲差異表達(dá)克隆有671個，代表基因262個，其中上調(diào)基因54個，下調(diào)基因208個基因，31個未知基

7、因；42d雄蟲差異表達(dá)克隆有171個，代表115個基因，其中上調(diào)基因94個，下調(diào)基因21個，未知基因8個。 2.聚類分析表明差異基因主要歸為9類變化趨勢。這9類基因的變化進(jìn)行深入分析可能可發(fā)現(xiàn)一些與蟲體發(fā)育過程中生物學(xué)變化特點相關(guān)的信息或線索。go的功能分析顯示，合抱前蟲體(13天，18天)的差異表達(dá)基因參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性(transcriptionregulatoractivity)，代謝(metabolism)，結(jié)合(bind

8、ing)，蛋白水解(proteolysis)相關(guān)；而合抱之后的蟲體(23天以后)差異表達(dá)基因，除了與代謝(metabolism)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性(transcriptionregulatoractivity)，生物合成(biosynthesis)等基本的生物學(xué)功能之外，出現(xiàn)較多的是與有性生殖(sexualreproduction)，配子發(fā)育(gametogenesis)，生殖(reproduction)，產(chǎn)卵(oviposition)等相

9、關(guān)的基因。這些特點的出現(xiàn)正和日本血吸蟲發(fā)育特征相符合。23天之后的蟲體處于雌雄蟲合抱、性成熟，生殖產(chǎn)卵階段。 3.盡管目前大部分血吸蟲基因都沒有明確注釋，對在本研究所發(fā)現(xiàn)的一些已知功能的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)他們在血吸蟲生長發(fā)育過程中具有重要功能。一些已經(jīng)得到公認(rèn)的疫苗候選分子如谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase)，Sj23(23kDaintegralmembraneprotein)，Ca2

10、+結(jié)合蛋白(calciumbindingprotein)，四跨膜蛋白(tetraspaninTE736)，sm20，參與重要信號通路的RAS相關(guān)蛋白，參與PKC信號通路的蛋白，一氧化氮合成酶蛋白抑制劑(neuronalnitricoxidsesynthaseproteininhibitor)，絲蘇氨酸蛋白酶抑制劑等在本研究中也被證實在不同發(fā)育階段呈差異表達(dá)。這也提示，血吸蟲差異表達(dá)基因包括一些功能不明確的差異表達(dá)基因，都具有深入研究的價

11、值。 三、日本血吸蟲新基因sj-fibrillin和sj-COG8全長cDNA的克隆與分析選擇兩個來自7d童蟲消減cDNA文庫中與數(shù)據(jù)庫中已知基因無同源的日本血吸蟲EST：SSH52.D11和SSH33.A7進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析。 根據(jù)SSH52.D11的EST序列，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到全長2251bp的cDNA序列，含有完整ORF，大小為2058bp，編碼685個氨基酸，理論分子量為79519.9，等電點為5.

12、22。用Interpro程序(http：//www.ebi.ac.uk/Interproscan)對SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有多個表皮生長因子功能域(EGFlikedomain)和表皮生長因子樣鈣結(jié)合位點(EGF-likecalcium-bindingsite)，與Fibrillin蛋白家族的特點相符合(Timpletal.，2003)，推測其屬于結(jié)構(gòu)蛋白Fibrillin家族，命名為sj-fibrillin。經(jīng)

13、查詢表明，該基因為日本血吸蟲新基因，Genbank登錄號分別為1067183(08年6月公開)。分別提取7d，13d，23d，42d的蟲體總RNA，選擇tublin作為內(nèi)參，利用熒光定量PCR法對該基因在日本血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體中的表達(dá)情況進(jìn)行實驗驗證，結(jié)果表明該基因在7d童蟲的表達(dá)量最高。選取人homo(Genebank登錄號1335064)，小鼠musmusculus(Genebank登錄號118136302)，光滑爪蟾Xenop

14、uslaevis(GenebankAccessionnumber83628282)等12個物種的fibrillin蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示日本血吸蟲的fibrillin蛋白在進(jìn)化上與小鼠最接近。對該基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明和人的fibrillin蛋白結(jié)構(gòu)相似。該基因編碼的蛋白作為細(xì)胞骨架蛋白Fibrillin基因在童蟲時期高表達(dá)，可能與童蟲快速生長，旺盛的細(xì)胞分化有關(guān)。 根據(jù)SSH33.A7的EST序列，利用RACE技

15、術(shù)擴(kuò)增得到全長2505bp的序列，含有完整的ORF，大小為2160bp，編碼719個氨基酸，理論分子量為85160.4，等電點為5.03。經(jīng)查詢，該基因為日本血吸蟲新基因，Genbank登錄號為EU131676.1。分別提取7d，42d的蟲體總RNA，選擇tublin作為內(nèi)參，利用熒光定量PCR法檢測表明，該基因在童蟲中的表達(dá)量高于在成蟲中的表達(dá)量。利用NCBI的CDD程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Str

16、ueture/cdd/cdd.shtml)對該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示該蛋白含有高爾基體寡居蛋白組分8(COG8)的保守結(jié)構(gòu)域Dor1。選取人Homosapiens(GeneBank登錄號21166361)，小鼠Musmusculus(GeneBank登錄號66392581)，斑馬魚Daniorerio(GeneBank登錄號61806582)等8個物種的COG8蛋白，進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的分析和比較。并使用最大簡約法(MP)繪制進(jìn)

17、化樹進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白屬于寡聚蛋白家族，并與寡聚蛋白組分8(COG8)相似，推測該基因編碼日本血吸蟲高爾基體寡聚蛋白組分8，命名為sj-COG8。COG蛋白是果蠅精子發(fā)育中的重要蛋白，與動物性腺發(fā)育相關(guān)。該蛋白在日本血吸蟲童蟲時期高表達(dá)可能在蟲體性別發(fā)育中發(fā)揮重要作用。 綜上，本研究首次構(gòu)建了日本血吸蟲早期童蟲期別差異表達(dá)cDNA消減文庫，發(fā)現(xiàn)了一批早期童蟲差異表達(dá)基因、不同生長發(fā)育階段蟲體差異表達(dá)基因及日本血