一氧化氮調(diào)控桃果實(shí)線粒體膜電壓依賴型離子通道蛋白的分子機(jī)理.pdf

1、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(membrane permeability transition pore，MPTP)在線粒體介導(dǎo)的程序性死亡（mitochondria-mediated apoptosis）過程中起著重要作用。電壓依賴型陰離子通道蛋白(voltage-dependent anion channel protein，VDAC protein)作為可以調(diào)節(jié)MPTP的重要因素，在植物體中的作用機(jī)理還不明確。一氧化氮（nitric ox

2、ide，NO）是一種可以介導(dǎo)植物多種生理功能與防御反應(yīng)的非生物信號(hào)分子，參與植物果實(shí)的成熟與衰老過程并可調(diào)控線粒體功能，外源NO在延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期中有著良好的效果。因此，研究外源NO對(duì)VDAC蛋白的影響及其作用機(jī)理，有助于明確VDAC蛋白在采后果實(shí)成熟衰老中的作用，對(duì)于保持果實(shí)品質(zhì)，延長(zhǎng)貯藏期具有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)第一部分是對(duì)肥城桃線粒體VDAC基因的克隆、VDAC蛋白的原核表達(dá)純化及NO與VDAC蛋白互作，第二部分研究了NO處

3、理后肥城桃線粒體性質(zhì)變化以及相關(guān)酶活性的變化。
　　根據(jù)GenBank已公布的番茄等植物VDAC基因保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物，通過RACE的方法，利用肥城桃果實(shí)總RNA克隆得到VDAC基因cDNA全長(zhǎng)1225 bp，包含5個(gè)內(nèi)含子接頭區(qū)，VDAC基因編碼區(qū)828 bp，編碼276個(gè)氨基酸。構(gòu)建VDAC-pET30a重組載體，通過大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，利用鎳柱進(jìn)行純化，得到純化的重組VDAC蛋白。研究了NO與VDAC蛋白作用

4、的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)NO可使VDAC蛋白溶液熒光強(qiáng)度下降，發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，該猝滅是一種靜態(tài)猝滅。使用類似Scatchard模型分析得知，NO可以與VDAC蛋白形成1∶1的復(fù)合物。NO處理肥城桃的研究結(jié)果顯示:在貯藏過程中，肥城桃果實(shí)線粒體的膜電勢(shì)呈下降趨勢(shì)，經(jīng)NO處理的肥城桃線粒體的膜電勢(shì)維持在相對(duì)較高的水平，其中經(jīng)15μmol·L-1 NO處理桃果實(shí)的線粒體膜電勢(shì)在貯藏過程中最高，其線粒體在離體實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)H2O2與Ca2+的高耐受力

5、。桃果實(shí)線粒體己糖激酶Ⅱ的活性在貯藏過程中持續(xù)升高，經(jīng)NO溶液處理的桃果實(shí)己糖激酶活性高于未處理及c-PTIO處理，其中經(jīng)15μmol·L-1 NO處理桃果實(shí)的己糖激酶Ⅱ的活性上升的最快且峰值最高。桃果實(shí)線粒體中Ca2+的含量在貯藏初期急速下降，然后維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，經(jīng)NO處理的桃果實(shí)線粒體中Ca2+的含量較高。15μmol·L-1 NO處理顯著上調(diào)了室溫貯藏后期桃果實(shí)VDAC表達(dá)，而c-PTIO則下調(diào)了VDAC表達(dá)。說明外源NO處