與PRRSV結(jié)合的受體SN氨基酸及其在PRRSV感染偏嗜性中的作用研究.pdf

1、豬繁殖呼吸綜合征PRRS（Porcine reproductive and respiratory syndrome，又稱藍(lán)耳病）是由PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）感染引起的，目前在世界范圍內(nèi)廣泛流傳，并且造成了感染豬繁殖障礙、免疫力低下、發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，并帶來(lái)肉產(chǎn)品安全及環(huán)境安全等隱患。
　　PRRSV感染而導(dǎo)致豬

2、免疫抑制及其免疫機(jī)制復(fù)雜，至今還沒(méi)有防治PRRSV的有效藥物與疫苗。PRRSV具有極強(qiáng)的宿主偏嗜性，只感染家豬和野豬，也不感染其它動(dòng)物。目前在豬PRRSV主要感染豬宿主PAM(Porcine Alveolar Macrophage)肺泡巨噬細(xì)胞，也從該細(xì)胞中鑒定出來(lái)了有CD163，CD169(SN，Sialoadhesin)等受體分子。在豬的SN受體具有黏附病毒唾液酸分子，介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞的能力，受體基因位點(diǎn)直接影響與PRRSV結(jié)合力，

3、對(duì)PRRSV受體研究是致病機(jī)理和抗病機(jī)理研究的趨勢(shì)之一。
　　因此，本研究從PPRSV細(xì)胞受體SN基因角度，以受體分子與PRRSV相互作用為重點(diǎn)，分析受體SN基因與PRRSV結(jié)合的重要氨基酸位點(diǎn)，研究該位點(diǎn)在與PRRSV結(jié)合和在PRRSV物種感染偏嗜性中的作用，探討受體和PRRSV的相互作用的機(jī)理，為抗PRRSV感染的防治藥物研制提供分子靶標(biāo)，為抗病分子育種提供參考。
　　一、利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與PRRSV結(jié)合的SN氨基酸位

4、點(diǎn):
　　1、將鼠SN中PDB數(shù)據(jù)庫(kù)所有SN蛋白模板和唾液酸的配體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)重疊和比對(duì)，確定了在6.5(A)范圍內(nèi)對(duì)結(jié)合唾液酸最關(guān)鍵的氨基酸;明確了唾液酸分子衍生物都有差異，但是鼠唾液酸分子都有保守的Neu5Ac的母核，而且在不同的PDB(Protein Data Bank)模板中，該母核位置保守和其形成氫鍵相互作用的氨基酸也是保守的。
　　2、根據(jù)豬SN基因cDNA及氨基酸序列，在Signal IP信號(hào)肽預(yù)測(cè)和蛋白結(jié)構(gòu)功能

5、Smart預(yù)測(cè)的網(wǎng)站上進(jìn)行預(yù)測(cè)，參照PDB上鼠SN的模板結(jié)構(gòu)，豬SN信號(hào)肽剪接位點(diǎn)可能在第19-20位氨基酸之間。
　　3、利用Smart對(duì)SN蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，確定豬SN參與病毒唾液酸結(jié)合的功能區(qū)域?yàn)镹末端的150個(gè)氨基酸以內(nèi)的區(qū)域。
　　4、利用糖基化預(yù)測(cè)網(wǎng)站和軟件，預(yù)測(cè)豬pSN的S107，T3，T78等位點(diǎn)，在PRRSV感染的過(guò)程中可能發(fā)生了糖基化。
　　5、根據(jù)豬SN和鼠SN的多序列進(jìn)行比對(duì)和結(jié)構(gòu)重疊的

6、結(jié)果，R97，R105氨基酸在PRRSV感染的過(guò)程中可能發(fā)生側(cè)鏈方向的改變，而且提供氫鍵以利于病毒唾液酸的結(jié)合。W106，W2氨基酸在結(jié)合唾液酸時(shí)，因?yàn)榫薮髠?cè)鏈空間阻礙和方向不變，可能限制PRRSV的唾液酸母核結(jié)合SN時(shí)的方向。
　　6、利用多序列比對(duì)和同源模建及分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化等，分別構(gòu)建了豬SN和牛SN的蛋白結(jié)構(gòu)模型;然后與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的鼠SN的蛋白結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行了結(jié)構(gòu)比對(duì)和重疊;再用Chimera軟件構(gòu)建分子突變體，最后觀

7、察豬SN、牛SN蛋白結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明:豬SN蛋白分子表面形成一個(gè)明顯的較深的孔洞，而牛的則不明顯;將豬SN的S107突變?yōu)榕N的V107時(shí)，豬SN的孔洞空間縮小，反之將牛SN的V107突變?yōu)樨iSN的S107時(shí)，牛SN的孔洞空間略有增加，因此預(yù)測(cè)豬SN的S107在PRRSV結(jié)合時(shí)可能具有重要作用。
　　7、通過(guò)比較分析豬SN的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)豬SN相對(duì)于鼠和牛的SN有其特異性，其表面的107位點(diǎn)是特異的親水氨基酸;在結(jié)合病毒唾液酸的

8、過(guò)程中，很可能提供了氫鍵和一個(gè)特異的親水區(qū)域以容納病毒的唾液酸，從而增加了病毒和豬SN的結(jié)合能力，這也許是豬個(gè)體間存在PRRSV易感性或抗性差異、不同物種間（豬、牛、鼠等）存在PRRSV感染偏嗜性差異的原因之一。此外，豬SN的2，44，45，97，105，106，109等位點(diǎn)的氨基酸，都參與了親水空間區(qū)域的形成。
　　二、利用分子生物學(xué)技術(shù)分析和驗(yàn)證生物信息預(yù)測(cè)的PRRSV結(jié)合的重要SN氨基酸位點(diǎn)及其作用:
　　1、為了研究

9、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的SN受體氨基酸位點(diǎn)（3、78和107）與PRRSV相互作用，根據(jù)豬pSN受體和牛cSN受體（不結(jié)合PRRSV唾液酸）序列，利用pEGFP-N1載體和定點(diǎn)突變技術(shù)分別構(gòu)建了豬和牛SN的2個(gè)野生型和4個(gè)突變體。它們包括2個(gè)野生型(pSN-GFP、cSN-GFP)、4個(gè)突變體(pSN-S 107V-GFP，pSN-T3V-GFP,pSN-T78V-GFP和cSN-V3T-V78T-V 107S-GFP)。
　　2、利用p

10、EGFP-N1載體分別構(gòu)建了GFP和SN融合蛋白的表達(dá)載體，并在293T細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)，利用采用超濾離心技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)液中獲得了純度較高的6個(gè)SN-GFP融合蛋白(pSN-GFP、cSN-GFP、pSN-S 107V-GFP，pSN-T3V-GFP，pSN-T78V-GFP和cSN-V3T-V78T-V 107S-GFP)，用于在分子水平研究受體SN與PRRSV的結(jié)合力的研究。
　　3、在SN-GFP載體的后端加上SN的跨膜片

11、段M，分別構(gòu)建了6個(gè)表達(dá)SN-GFP-M載體(pSN-S 107V-GFP-M,pSN-T3V-GFP-M,pSN-T78V-GFP-M,cSN-V3T-V78T-V 107S-GFP-M，pSN-GFP-M，cSN-GFP-M)和1個(gè)對(duì)照GFP-M載體，在293T細(xì)胞中表達(dá)7個(gè)SN-GFP-M融合蛋白，用于在細(xì)胞水平分析受體SN與PRRSV的相互作用的分析。
　　4、利用WB(Western Blot)技術(shù)證明和鑒定了本研究所表

12、達(dá)蛋白分別為6個(gè)SN-GFP融合蛋白、7個(gè)SN-GFP-M融合蛋白。
　　5、分別利用FAR-WB（FAR-Western Blot）技術(shù)、ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)技術(shù)分析了SN-GFP蛋白和PRRSV的結(jié)合活性。分別分析了2個(gè)SN野生型融合蛋白(pSN-GFP、cSN-GFP)和4個(gè)突變體融合蛋白(pSN-S 107V-GFP,pSN-T3V-GFP,pSN-T78V-GF

13、P和cSN-V3T-V78T-V107S-GFP)與PRRSV的結(jié)合力，結(jié)果表明:豬野生型pSN-GFP蛋白的結(jié)合高于其它5種蛋白的結(jié)合，發(fā)生突變后的豬SN蛋白(pSN-S 107V-GFP,pSN-T3V-GFP，pSN-T78V-GFP)的結(jié)合力都降低，特別是pSN-S 107V-GFP蛋白結(jié)合力顯著的下降;而牛野生型cSN-GFP蛋白不能與PRRSV結(jié)合，但發(fā)生突變(cSN-V3T-V78T-V107S-GFP)蛋白能與少量PRR

14、SV結(jié)合。
　　6、利用免疫細(xì)胞熒光技術(shù)，分析了SN-GFP-M蛋白和PRRSV的結(jié)合活性。在293T細(xì)胞中分別表達(dá)了6個(gè)帶SN的跨膜片段M的SN-GFP-M和1個(gè)對(duì)照GFP-M蛋白，利用免疫細(xì)胞熒光技術(shù)，分別探討了豬和牛SN野生型融合蛋白、3個(gè)豬突變體融合蛋白、1個(gè)牛突變體融合蛋白、1個(gè)對(duì)照GFP-M蛋白與PRRSV的結(jié)合力，試驗(yàn)結(jié)果與利用FAR-WB技術(shù)分析的結(jié)果相類(lèi)似。
　　7、以上所有結(jié)果表明豬SN基因中第T3、T7

15、8和S107氨基酸在與PRRSV結(jié)合中具有一定的作用，特別是S107位具有重要的作用。
　　8、豬pSN野生型具有強(qiáng)的PRRSV結(jié)合能力，本試驗(yàn)將豬相應(yīng)氨基酸替換成牛的氨基酸，豬pSN突變型pSN-T78V、pSN-T3V降低了結(jié)合PRRSV能力，pSN-S 107V顯著地降低了結(jié)合能力。而將牛SN進(jìn)行cSN-V107S突變，將牛替換成了豬的氨基酸，生物信息分析顯示可以恢復(fù)部分的結(jié)合PRRSV的能力;并且牛的突變體cSN-V3T-