波形蛋白對(duì)PRRSV感染細(xì)胞的作用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的接觸性傳染病。該病主要引起妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道癥狀和高死亡率。該病于1987年首先發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，隨后波及多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。郭寶清在1996年首次

2、從流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV，證實(shí)了PRRSV在我國(guó)的存在(郭寶清，1996)。該病造成較高的發(fā)病率和死亡率，而且臨床癥狀逐漸復(fù)雜，流行范圍逐漸擴(kuò)大。目前PRRS已經(jīng)遍及全球主要養(yǎng)豬的國(guó)家和地區(qū)，且尚無(wú)有效的疫苗能夠控制該病的發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。波形蛋白作為PRRSV受體之一，與其他中間絲蛋白一起在PRRSV感染細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，但作用機(jī)理尚不明確。
　　 為了研究豬波形蛋白在介導(dǎo)PRRSV感染細(xì)胞過程

3、中的作用，利用RT-PCR方法從PRRSV非易感細(xì)胞系豬腎細(xì)胞系PK-15細(xì)胞中擴(kuò)增目的基因，克隆入pET-28a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的重組豬波形蛋白經(jīng)SDS-PAGE、Westernblot鑒定和提純后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。利用病毒阻斷試驗(yàn)檢測(cè)重組豬波形蛋白及多克隆抗體在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞過程中的作用。結(jié)果表明，豬波形蛋白基因從PK-15細(xì)胞中得到成功擴(kuò)增并克隆入pET-2

4、8a載體，經(jīng)誘導(dǎo)后得到高效表達(dá)。重組豬波形蛋白經(jīng)純化后具有良好的免疫原性，刺激兔子產(chǎn)生高價(jià)血清抗體(105)，并有效阻斷PRRSV感染Marc-145細(xì)胞。兔血清抗體通過特異性結(jié)合波形蛋白完全阻斷PRRSV感染Marc-145細(xì)胞。
　　 將本實(shí)驗(yàn)室獲得的非洲綠猴腎細(xì)胞(Marc-145)波形蛋白基因與EmGFP基因、IRES基因共同克隆到pcDNA3.1/V5-HisA載體中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GIV。通過非脂

5、質(zhì)體轉(zhuǎn)染將其轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，經(jīng)G418加壓篩選，單克隆挑取，獲得穩(wěn)定表達(dá)猴源波形蛋白的細(xì)胞系BHK-21-GIV。細(xì)胞系經(jīng)Westernblot和RT-PCR檢測(cè)，證明外源波形蛋白成功得到表達(dá)。將獲得的BHK-21-GIV細(xì)胞系與PRRSV進(jìn)行10次病毒適應(yīng)傳代，通過間接免疫熒光檢測(cè)，觀察到可以感染PRRSV的BHK-21-GIV細(xì)胞。
　　 同時(shí)根據(jù)獲得的猴源波形蛋白基因序列分別設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，結(jié)果分別得到了預(yù)期的基

6、因片段，其大小分別為：807bp、876bp、1002bp、594bp。將目的基因克隆入pET-28a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)的重組蛋白大小分別約為34.3kD、38.2kD、42.6kD和26.5kD，與預(yù)期結(jié)果相吻合。經(jīng)Western-blot檢測(cè)，所獲得的各段重組蛋白均能與抗His-單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。利用I-ELISA方法驗(yàn)證表達(dá)的四段重組猴源波形蛋白與PRRSV的核