波形蛋白對PRRSV感染細胞的作用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的接觸性傳染病。該病主要引起妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道癥狀和高死亡率。該病于1987年首先發(fā)現(xiàn)于美國，隨后波及多個國家和地區(qū)。郭寶清在1996年首次

2、從流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV，證實了PRRSV在我國的存在(郭寶清，1996)。該病造成較高的發(fā)病率和死亡率，而且臨床癥狀逐漸復(fù)雜，流行范圍逐漸擴大。目前PRRS已經(jīng)遍及全球主要養(yǎng)豬的國家和地區(qū)，且尚無有效的疫苗能夠控制該病的發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。波形蛋白作為PRRSV受體之一，與其他中間絲蛋白一起在PRRSV感染細胞過程中發(fā)揮重要作用，但作用機理尚不明確。
　　 為了研究豬波形蛋白在介導(dǎo)PRRSV感染細胞過程

3、中的作用，利用RT-PCR方法從PRRSV非易感細胞系豬腎細胞系PK-15細胞中擴增目的基因，克隆入pET-28a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達。表達的重組豬波形蛋白經(jīng)SDS-PAGE、Westernblot鑒定和提純后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。利用病毒阻斷試驗檢測重組豬波形蛋白及多克隆抗體在PRRSV感染Marc-145細胞過程中的作用。結(jié)果表明，豬波形蛋白基因從PK-15細胞中得到成功擴增并克隆入pET-2

4、8a載體，經(jīng)誘導(dǎo)后得到高效表達。重組豬波形蛋白經(jīng)純化后具有良好的免疫原性，刺激兔子產(chǎn)生高價血清抗體(105)，并有效阻斷PRRSV感染Marc-145細胞。兔血清抗體通過特異性結(jié)合波形蛋白完全阻斷PRRSV感染Marc-145細胞。
　　 將本實驗室獲得的非洲綠猴腎細胞(Marc-145)波形蛋白基因與EmGFP基因、IRES基因共同克隆到pcDNA3.1/V5-HisA載體中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GIV。通過非脂

5、質(zhì)體轉(zhuǎn)染將其轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，經(jīng)G418加壓篩選，單克隆挑取，獲得穩(wěn)定表達猴源波形蛋白的細胞系BHK-21-GIV。細胞系經(jīng)Westernblot和RT-PCR檢測，證明外源波形蛋白成功得到表達。將獲得的BHK-21-GIV細胞系與PRRSV進行10次病毒適應(yīng)傳代，通過間接免疫熒光檢測，觀察到可以感染PRRSV的BHK-21-GIV細胞。
　　 同時根據(jù)獲得的猴源波形蛋白基因序列分別設(shè)計了4對引物，結(jié)果分別得到了預(yù)期的基

6、因片段，其大小分別為：807bp、876bp、1002bp、594bp。將目的基因克隆入pET-28a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達的重組蛋白大小分別約為34.3kD、38.2kD、42.6kD和26.5kD，與預(yù)期結(jié)果相吻合。經(jīng)Western-blot檢測，所獲得的各段重組蛋白均能與抗His-單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。利用I-ELISA方法驗證表達的四段重組猴源波形蛋白與PRRSV的核