PRRSV感染對(duì)細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）的病原，疾病主要特征是母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸道疾病。該病在豬群中廣泛傳播，嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，也是豬病防控的一大難題。目前對(duì)該病尚無(wú)有效的治療手段，在實(shí)踐中需采用綜合防治措施

2、才能有效降低或阻斷本病的發(fā)生與傳播。為了減少PRRS造成的不利影響，更好的控制本病，亟待對(duì)PRRSV的致病機(jī)制進(jìn)行更深入的了解與研究。
　　在真核細(xì)胞中，細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂是以細(xì)胞周期的形式進(jìn)行的。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)(cellcycle checkpoint)作為負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，確保了細(xì)胞周期事件正確合理運(yùn)行。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，這些檢查點(diǎn)被激活發(fā)揮作用，細(xì)胞周期運(yùn)行被阻斷，細(xì)胞完成修復(fù)保證細(xì)胞周期正常運(yùn)轉(zhuǎn)，若損傷不能及時(shí)修復(fù)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋

3、亡。損傷引起的細(xì)胞周期停滯激活相關(guān)的信號(hào)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)或磷酸化水平發(fā)揮作用的。眾多研究表明，在感染過(guò)程中，許多病毒及其相關(guān)蛋白可以擾亂細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盡管有關(guān)PRRSV致病機(jī)制的研究報(bào)道已經(jīng)很多，但PRRSV感染對(duì)細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制目前卻鮮有報(bào)道。本研究以PRRSV感染MARC-145細(xì)胞，探索PRRSV感染對(duì)細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制，主要內(nèi)容如下:
　　1.用PRRSV SD16株感染MARC-1

4、45細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察到明顯的細(xì)胞病變，采用IFA和Western blot技術(shù)檢測(cè)到病毒感染細(xì)胞中存在大量的PRRSV N蛋白。
　　2.根據(jù)Cell Counting Kit-8（CCK-8）說(shuō)明，繪制MARC-145細(xì)胞數(shù)與450 nm吸光度值(OD450nm)的標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得回歸方程“y=0.3098 ln(x)-1.7214，R2=0.998”;以不同感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection，M

5、OI)PRRSV SD16株感染MARC-145細(xì)胞，檢測(cè)感染后不同時(shí)間的OD450nm，根據(jù)回歸方程，計(jì)算感染后不同時(shí)間的細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，不同劑量PRRSV SD16株感染MARC-145細(xì)胞，均可抑制細(xì)胞的增殖，綜合考慮選擇1 MOI感染劑量。
　　3.通過(guò)Annexin V-PI雙染發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染可誘導(dǎo)MARC-145細(xì)胞凋亡，且凋亡細(xì)胞數(shù)隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加。PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染可導(dǎo)致MAR

6、C-145細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。
　　4.IFA和Western blot技術(shù)檢測(cè)顯示，PRRSV感染引起MARC-145細(xì)胞中CyclinB1表達(dá)豐度升高且移位于細(xì)胞核;Cdc2磷酸化(p-Cdc2)（Tyr15）水平升高且核分布增加;p53總表達(dá)量及p-p53(Ser15)的表達(dá)均顯著增加;14-3-3σ的表達(dá)顯著增加。Western blot及CoIP技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，p21表達(dá)顯著升高且p21與Cdc2-CyclinB1復(fù)

7、合物之間存在互作。表明PRRSV感染導(dǎo)致的MARC-145細(xì)胞周期G2/M期阻滯與p53/p21信號(hào)通路活化有關(guān)。
　　5.通過(guò)qPCR和Western blot技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染的MARC-145細(xì)胞中，Wee1、Myt1轉(zhuǎn)錄水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而蛋白表達(dá)水平均增加;Cdc25C表達(dá)變化不明顯，但p-Cdc25C(Ser345)表達(dá)顯著升高且主要分布于細(xì)胞質(zhì)中;Chk1和p-Chk1(Ser34