中華絨螯蟹(Eriochier sinensis)血細(xì)胞組成、功能及體外培養(yǎng)的研究.pdf

1、作為細(xì)胞免疫的承擔(dān)者和體液免疫相關(guān)免疫因子的提供者,血細(xì)胞在甲殼動(dòng)物非特異性免疫中有著重要的作用,包括吞噬、包囊、黑化、細(xì)胞毒性、胞間信息傳遞以及酚氧化酶原系統(tǒng)的激活等。本研究選取在我國具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要淡水養(yǎng)殖品種中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)作為研究對象,通過對其血細(xì)胞進(jìn)行多種細(xì)胞學(xué)染色和免疫相關(guān)酶染色,并測定其在嗜水氣單胞菌注射后血淋巴中總血細(xì)胞數(shù)(THC)和不同血細(xì)胞比例(DHC)的變化,研究其血細(xì)胞種類

2、、各類型比例,以及在免疫應(yīng)答過程中各類型細(xì)胞比例的變化;通過對血細(xì)胞在不同培養(yǎng)基、血清、pH、溫度和滲透壓條件下進(jìn)行離體培養(yǎng),確定了最佳的培養(yǎng)條件;對各類型血細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)。這些研究為今后血細(xì)胞的發(fā)生、免疫機(jī)制以及建立細(xì)胞系的研究提供了基礎(chǔ)資料,研究結(jié)果如下:
　　1.通過對中華絨螯蟹血細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)染色和免疫相關(guān)酶染色分析,將中華絨螯蟹血細(xì)胞分為四類:大顆粒細(xì)胞(Granulocyte, G)、中間型顆粒細(xì)胞(Interme

3、diate Granulocyte,IG)、小顆粒細(xì)胞(Semigranulocyte,SG)和透明細(xì)胞(Hyalinocyte,H)。四種細(xì)胞中,大顆粒細(xì)胞體型最大,同中間型細(xì)胞一樣含有嗜酸性顆粒;小顆粒細(xì)胞數(shù)量最多,含有大量嗜堿性顆粒;而透明細(xì)胞體型最小,基本不含任何顆粒物質(zhì)。四種細(xì)胞中均含有多糖成分而不含脂類物質(zhì);只有大顆粒細(xì)胞在四種水解或氧化酶檢測中顯示陽性反應(yīng)。通過體外注射嗜水氣單胞菌,中華絨螯蟹血淋巴THC發(fā)生不同程度變化。

4、其中注射組(注射濃度1×109 CFU/ml嗜水氣單胞菌100μl)較生理鹽水組(注射蟹生理鹽水100μl)變化更明顯,在6h THC達(dá)到最大值,顯著高于其余兩組(P<0.05),然后逐漸降低到接近正常水平。而注射組的DHC檢測結(jié)果顯示:透明細(xì)胞數(shù)量在注射后3h大幅度增加,6h后達(dá)到最大值,比最初增加了接近一倍,然后有所回落;小顆粒細(xì)胞數(shù)量基本保持不變;而其他各類型細(xì)胞數(shù)量均有不同程度下降,其中大顆粒細(xì)胞數(shù)量持續(xù)下降,在12h降至最低,

5、相比正常值降低了約一倍,然后有所回升。本研究證實(shí),不同類型中華絨螯蟹血細(xì)胞有著不同的結(jié)構(gòu)與功能。其中,大顆粒細(xì)胞有較高的酶活性而透明細(xì)胞有較強(qiáng)的直接抗病菌作用,他們在免疫應(yīng)答過程中共同作用來抵御病原物質(zhì)的入侵。
　　2.比較了幾種常見血細(xì)胞培養(yǎng)基(L-15、2×L-15、3×L-15、M199和RMPI-1640)對中華絨螯蟹血細(xì)胞離體培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)以及存活率的影響,以及在篩選獲得的最佳培養(yǎng)基中添加不同比例胎牛血清(FBS)(0％

6、、5%、10%和15%),進(jìn)一步觀察了血清對中華絨螯蟹血細(xì)胞培養(yǎng)效果的比較。結(jié)果表明,3×L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)效果較好,所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)相對完整,數(shù)量較多,培養(yǎng)至96 h時(shí)血細(xì)胞存活率仍大于60%;而其他4種培養(yǎng)基效果較差,培養(yǎng)12 h存活率均低于50%,且細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化明顯。以3×L-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加不同比例胎牛血清后發(fā)現(xiàn),對細(xì)胞存活有顯著影響,存活率明顯降低。因此,不添加血清的3×L-15培養(yǎng)基對中華絨螯蟹血細(xì)胞的生長較為適宜

7、。
　　3.研究了不同pH(6.4、6.8、7.2、7.6和8.0)、溫度(26、28和30℃)和滲透壓(500、700、900、1100和1300 mOsM kg-1)對中華絨螯蟹血細(xì)胞離體培養(yǎng)中細(xì)胞存活率和細(xì)胞形態(tài)的影響,并比較了在不同培養(yǎng)基下(L-15和3×L-15)改變滲透壓(1100和1300 mOsM kg-1)對其離體培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明,3×L-15培養(yǎng)基調(diào)整滲透壓至1100 mOsM kg-1,pH6.8,28℃