中華絨螯蟹螺原體侵染羅氏沼蝦血細胞過程中互作蛋白的篩選及功能研究.pdf

1、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)又稱馬來西亞大蝦、淡水長臂大蝦，是世界上個體最大的淡水蝦之一，同時也是目前國內(nèi)主要的三大淡水經(jīng)濟蝦類之一。自1976年引入中國以來，該品種在國內(nèi)的養(yǎng)殖面積逐年擴大、產(chǎn)量逐年增加。然而，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大及集約化程度的提高，一些由細菌、病毒等引起的病害日趨嚴重，其中還包括新型病原——中華絨螯蟹螺原體。前期研究表明，中華絨螯蟹螺原體通過鰓或體表進入河蟹體內(nèi)，侵染其靶細胞——

2、小顆粒血細胞，在血細胞中大量繁殖，然后通過血細胞的流通將病原帶到機體各器官的結(jié)締組織中，并侵染到神經(jīng)和肌肉組織，造成病蟹感染前期的無力不食和感染后期的附肢顫抖等病癥。但作為一種沒有細胞壁的特殊細菌病原是如何黏附、侵染宿主靶細胞?在病原與宿主博弈過程中有哪些關(guān)鍵的蛋白相互作用？
　　本博士學位論文在前期研究的基礎(chǔ)上，首先通過相對和絕對定量同位素標記(isobaric tags forrelative and absolute qua

3、ntitation，iTRAQ)技術(shù)，篩選螺原體感染7天后羅氏沼蝦血細胞中的差異蛋白，通過蛋白質(zhì)組學來分析螺原體可能的感染機制以及宿主的防御機理。其次，利用Far-western印記技術(shù)篩選羅氏沼蝦血細胞的候選受體蛋白，體外細菌結(jié)合及激光共聚焦實驗對所得到的受體蛋白進行驗證，通過合成特異性雙鏈RNA，在羅氏沼蝦個體水平研究受體基因功能。最后，利用Far-western印記技術(shù)篩選對應(yīng)螺原體的配體蛋白，體外培養(yǎng)羅氏沼蝦血細胞，在細胞水平通

4、過競爭性實驗對配體蛋白功能進行研究。本論文為螺原體侵染機理及宿主免疫防御機制的深入研究奠定了良好的基礎(chǔ)，本文研究結(jié)果主要包括以下6個方面:
　　1.iTRAQ篩選螺原體感染前后羅氏沼蝦血細胞的差異蛋白
　　本實驗通過iTRAQ的研究，動態(tài)、整體、定量地觀察螺原體感染前后羅氏沼蝦血細胞蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變。篩選羅氏沼蝦血細胞經(jīng)過螺原體感染后的差異蛋白譜，初步鑒定出具有明確功能的蛋白與結(jié)合、催化、結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運等分子功能有關(guān)。本實

5、驗選擇差異倍數(shù)大于等于1.5的蛋白進行功能分析，實驗中篩選出69個具有統(tǒng)計學意義的差異顯著蛋白質(zhì)。上調(diào)蛋白中，包括6個免疫相關(guān)蛋白，14個生理性蛋白，25個胞內(nèi)蛋白，4個未知/假設(shè)蛋白。下調(diào)蛋白中，包括4個免疫相關(guān)蛋白，3個骨架蛋白，11個生理性蛋白，2個未知/假設(shè)蛋白。選擇其中7個蛋白，通過qRT-PCR檢測對應(yīng)mRNA水平的表達變化，結(jié)果表明基本與iTRAQ篩選結(jié)果保持一致。
　　2.Far-western印跡篩選羅氏沼蝦受體

6、蛋白
　　羅氏沼蝦血細胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以甲醛固定過的螺原體為覆蓋蛋白，然后依次孵育抗螺原體的兔多抗和抗兔的熒光標記二抗。綜合Far-western結(jié)果，本實驗初步從羅氏沼蝦血細胞總蛋白中釣取了6種可能與S.eriocheiris相互作用的受體蛋白。根據(jù)分子功能，將受體蛋白分為三大類:細胞骨架、先天性免疫系統(tǒng)、信號傳導(dǎo)因子。細胞骨架，包括Beta-Actin、Beta-Tubulin及Alpha-T

7、ubulin蛋白。先天性免疫系統(tǒng)，包括LGBP和proPO蛋白。信號傳導(dǎo)因子，包括Ran蛋白。
　　3.Beta-Actin蛋白原核表達及受體功能驗證
　　在此部分實驗中，以Beta-Actin為研究對象通過細菌結(jié)合及激光共聚焦實驗來驗證其作為受體蛋白的可靠性。體外細菌結(jié)合實驗，將純化的Beta-Actin重組蛋白與螺原體室溫結(jié)合2h，然后PBS多次洗脫，最后用8M脲強力洗脫，結(jié)果Beta-Actin依然可以結(jié)合在螺原體的表

8、面。激光共聚焦結(jié)果顯示綠色熒光標記的螺原體貼附在紅色熒光的Actin蛋白上，兩者相互疊加產(chǎn)生黃色熒光，進一步從細胞水平證實Beta-Actin與螺原體存在相互作用。
　　4.LGBP蛋白原核表達及受體功能研究
　　LGBP通常都能夠識別并結(jié)合脂多糖及β-1，3-葡聚糖，從而參與革蘭氏陰性菌和真菌的識別及防御，但是LGBP對于缺乏細胞壁細菌的識別還尚未有過報道。本研究首先重組表達并純化LGBP蛋白，體外細菌結(jié)合實驗證實LGBP

9、蛋白能夠與螺原體相結(jié)合。激光共聚焦實驗，采用抗LGBP鼠多抗和Alexa Fluor555標記驢抗小鼠二抗來特異性的標記羅氏沼蝦血細胞的LGBP蛋白，結(jié)果顯示綠色熒光標記的螺原體貼附在紅色熒光的LGBP蛋白上。接下來，合成LGBP特異性雙鏈RNA，觀察LGBP基因干擾對于螺原體拷貝數(shù)和羅氏沼蝦存活率的影響。結(jié)果表明，螺原體感染后第3天，LGBP dsRNA注射組的羅氏沼蝦血細胞中螺原體拷貝數(shù)明顯少于GFP dsRNA和PBS注射組。羅氏

10、沼蝦存活率統(tǒng)計顯示，LGBP基因的沉默增加了宿主對螺原體侵染的敏感性，死亡率要高于兩個對照組。以上結(jié)果表明，LGBP作為胞外受體蛋白參與了螺原體黏附細胞的過程，但是除了LGBP之外應(yīng)該還有其他的受體蛋白。
　　5.Ran基因克隆、蛋白原核表達及功能研究
　　前期研究表明，對蝦和果蠅小G蛋白Ran參與了病毒吞噬過程。本研究進一步探討Ran介導(dǎo)螺原體的吞噬作用，揭示Ran調(diào)控細胞吞噬的分子機制。首先，利用質(zhì)譜所得肽段序列設(shè)計簡并

11、引物擴增Ran基因的中間序列，并通過RACE技術(shù)擴增得到基因全長。然后，通過體外細菌結(jié)合實驗證實Ran蛋白能夠與螺原體相結(jié)合。最后，合成Ran特異性雙鏈RNA，觀察Ran基因干擾對于螺原體拷貝數(shù)和羅氏沼蝦存活率的影響。結(jié)果表明MrRan-dsRNA注射組中螺原體拷貝數(shù)明顯少于對照組，該組中羅氏沼蝦存活率也要高于兩個對照組。推測羅氏沼蝦Ran蛋白作為胞內(nèi)受體蛋白參與了S.eriocheiris的吞噬過程，MrRan可能參與了吞噬作用中異物

12、攝入過程。
　　6.Far-western印記篩選螺原體配體蛋白及配體蛋白功能驗研究
　　通過Far Western印記篩選Beta-Actin及LGBP的配體蛋白，Beta-Actin的候選配體蛋白為轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)，LGBP蛋白的候選配體蛋白分別為烯醇酶（enolase）、轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase)和RNA聚合酶β亞基(