馬鈴薯甲蟲(chóng)保幼激素合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的克隆和功能分析.pdf

1、馬鈴薯甲蟲(chóng)(Leptinotarsa decemlineata)是北美洲、歐洲和亞洲的大部分國(guó)家馬鈴薯上最重要的食葉害蟲(chóng)，也是我國(guó)對(duì)外重大檢疫對(duì)象和重要外來(lái)入侵物種。嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可致使馬鈴薯減產(chǎn)一半以上，甚至絕收。長(zhǎng)期的農(nóng)藥防治使馬鈴薯甲蟲(chóng)的抗藥性日漸增強(qiáng)，急需研究和開(kāi)發(fā)新的防治技術(shù)?；蚋蓴_(RNAi)作為新的科學(xué)研究手段，不僅可以用于基因功能的研究，還可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式轉(zhuǎn)入植物或者工程菌內(nèi)，這為害蟲(chóng)防治提供了新的思路。保幼激素是調(diào)節(jié)

2、昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素，而且只在昆蟲(chóng)等生物內(nèi)存在。因此，研究保幼激素相關(guān)基因功能對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的研究及害蟲(chóng)治理新措施的開(kāi)發(fā)都具有重大意義。
　　本文克隆了9個(gè)馬鈴薯甲蟲(chóng)保幼激素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并采用RNA干擾方法研究了3個(gè)合成相關(guān)基因被抑制后對(duì)幼蟲(chóng)的影響，確定這些基因是否能成為RNAi防治害蟲(chóng)的潛在靶基因。現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1、馬鈴薯甲蟲(chóng)保幼激素合成相關(guān)基因的克隆
　　根據(jù)家蠶和

3、赤擬谷盜等基因組中已經(jīng)公布的相關(guān)基因的信息，從馬鈴薯甲蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組中，獲得了3條保幼激素合成相關(guān)基因片段，它們分別是:保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶、法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶腺苷高半胱氨酸水解酶。通過(guò)常規(guī)PCR，驗(yàn)證了這些基因片段的真實(shí)性，進(jìn)而利用RACE技術(shù)，克隆出了這些基因的全長(zhǎng)序列。通過(guò)氨基酸序列多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些基因與其他物種均有較高的相似性。同時(shí)，應(yīng)用qPCR技術(shù)，測(cè)得了3個(gè)保幼激素合成相關(guān)基因不同發(fā)育期的相對(duì)表達(dá)量。這些基因的mRNA水平與馬鈴薯

4、甲蟲(chóng)中保幼激素滴度變化基本一致。
　　2、馬鈴薯甲蟲(chóng)保幼激素合成相關(guān)基因的RNA干擾效應(yīng)
　　通過(guò)大腸桿菌表達(dá)dsRNA的方法，對(duì)保幼激素合成途徑中的保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶、法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶和腺苷高半胱氨酸水解酶3個(gè)基因進(jìn)行了RNA干擾實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，喂食保幼激素合成相關(guān)基因dsRNA之后，幼蟲(chóng)體內(nèi)3個(gè)靶基因的表達(dá)量均顯著下降?；虺聊共糠衷囅x(chóng)死亡，部分幼蟲(chóng)表型異常，化蛹和羽化均受阻。保幼激素類(lèi)似物吡丙醚可以部分補(bǔ)償合成酶相

5、關(guān)基因沉默產(chǎn)生的不利影響。
　　3、馬鈴薯甲蟲(chóng)JH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的克隆及干擾JH代謝基因?qū)ζ浔磉_(dá)的影響
　　獲得了6個(gè)保幼激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因全長(zhǎng)cDNA，它們分別是:核受體轉(zhuǎn)錄激活因子2、Kruppel-homolog 1、烯蟲(chóng)酯耐受蛋白和Broad家族3個(gè)基因。攝入保幼激素合成相關(guān)基因dsRNA之后，部分保幼激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)量也有不同程度下調(diào)。而保幼激素類(lèi)似物吡丙醚可以部分恢復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)。