野生馬鈴薯Solanum pinnatisectum抗寒相關(guān)基因SpCBF1的克隆及功能分析.pdf

1、馬鈴薯是繼水稻、玉米、小麥之后的世界第四大農(nóng)作物。馬鈴薯喜溫涼，既不耐高溫，也不耐低溫。在生長(zhǎng)過(guò)程中如遇到低溫，不但會(huì)影響到馬鈴薯的生長(zhǎng)，還會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)量降低。選育抗寒馬鈴薯品種，是解決冷害問(wèn)題的重要途徑。植物在進(jìn)化過(guò)程中，會(huì)逐步地產(chǎn)生抵御能力以維持自身的生存。在以往的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些與抗寒相關(guān)基因，如:COR、FAD、CBF等。其中，研究得較多的是CBF家族基因，已經(jīng)在擬南芥、番茄、大麥、科民茄中得到克隆。本研究采用分子生物學(xué)方法從

2、耐寒的野生種馬鈴薯Solanum pinnatisectum中克隆SpCBF1基因，并通過(guò)過(guò)表達(dá)和反義抑制技術(shù)研究該基因的功能。獲得如下研究成果:
　　1.利用RT-PCR技術(shù)從Solanum pinnatisectum中分離得到SpCBF1基因，測(cè)序結(jié)果顯示，該基因開放閱讀框?yàn)?69 bp，不合內(nèi)含子，編碼一個(gè)含222個(gè)氨基酸殘基的蛋白。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，其含有與其他CBF家族蛋白相同的保守序列，該保守序列不僅包括AP2結(jié)

3、構(gòu)域，還包括位于AP2結(jié)構(gòu)域上下游的PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR氨基酸序列。疏水性分析顯示，SpCBF1蛋白為親水性蛋白。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SpCBF1蛋白由兩種二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，分別是位于N端的1個(gè)α-螺旋和位于C端的3個(gè)β-折疊，這與其他CBF家族蛋白相同。蛋白進(jìn)化分析顯示，SpCBF1與其他茄科植物的CBF在同一簇中，并且與來(lái)自于科民茄Solanum commersonii的ScCBF1蛋白具有最近的親緣

4、關(guān)系。
　　2.為了驗(yàn)證SpCBF1基因的功能，我們分別構(gòu)建了SpCBF1基因的過(guò)表達(dá)載體和反義載體，并將其轉(zhuǎn)化到馬鈴薯栽培品種中，通過(guò)PCR、半定量RT-PCR及qRT-PCR分析，鑒定得到10個(gè)過(guò)表達(dá)株系和9個(gè)反義株系。
　　3.對(duì)轉(zhuǎn)SpCBF1基因植株進(jìn)行抗寒性鑒定，結(jié)果顯示，自然越冬狀態(tài)下，低溫對(duì)過(guò)表達(dá)株系造成的傷害低于對(duì)照，而反義株系傷害程度大于對(duì)照，表明SpCBF1基因過(guò)表達(dá)能提高了馬鈴薯的抗寒性。
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5、.另外檢測(cè)了抗寒相關(guān)生理生化指標(biāo):相對(duì)含水量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量。結(jié)果顯示，在低溫處理后，過(guò)表達(dá)植株與對(duì)照相比，相對(duì)含水量、超氧化物歧化酶活性、脯氨酸含量及可溶性糖含量與對(duì)照相比都有所上升，丙二醛含量下降，反義植株相反。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明SpCBF1基因在馬鈴薯抗寒中起到正調(diào)控作用。
　　5.為了弄清SpCBF1基因的作用機(jī)理，我們檢測(cè)了兩種COR基因(DHN10和StP1)在轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照