馬鈴薯甲蟲(chóng)FTZ-F1基因的分子克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、昆蟲(chóng)的變態(tài)主要是在保幼激素和蛻皮激素的協(xié)同調(diào)節(jié)作用下發(fā)生的。二者均是同其受體因子結(jié)合，繼而調(diào)控信號(hào)通路中下游基因的表達(dá)，啟動(dòng)變態(tài)的發(fā)生。兩條激素信號(hào)通路之間能通過(guò)一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用。核受體型轉(zhuǎn)錄因子FTZ-F1即是其中之一。
　　核受體型轉(zhuǎn)錄因子在其變態(tài)、生殖、滯育中起到關(guān)鍵作用，已有研究表明，在黑腹果蠅中有兩個(gè)FTZ-F1變體:DmαFTZ-F1和DmβFTZ-F1。 DmαFTZ-F1在胚胎形成時(shí)發(fā)揮重要作用，而DmβFTZ

2、-F1在幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)時(shí)期不可或缺，對(duì)幼蟲(chóng)的蛻皮及蛹期精確調(diào)控。在鞘翅目、鱗翅目、膜翅目等昆蟲(chóng)以及其他物種中，都部分驗(yàn)證了FTZ-F1的重要性?？梢?jiàn)， FTZ-F1對(duì)生物的發(fā)育十分重要，具有很大的研究?jī)r(jià)值。
　　馬鈴薯甲蟲(chóng)主要為害茄科植物，是一種重要的食葉害蟲(chóng)。本文中，依據(jù)馬鈴薯甲蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)得到LdFTZ-F1的片段后，通過(guò)RT-PCR、RACE等手段獲得LdFTZ-F1的兩個(gè)變體;構(gòu)建干擾載體dsLdFTZ-F1;用RNA干

3、擾的方法探究LdFTZ-F1在幼蟲(chóng)向蛹轉(zhuǎn)變過(guò)程中的作用;用qPCR的方法檢測(cè)沉默LdFTZ-F1后基因表達(dá)量，推究LdFTZ-F1在蛻皮激素和保幼激素信號(hào)通路中的作用，及沉默該基因致使化蛹失敗的原因。
　　本文的研究結(jié)果如下:
　　1、馬鈴薯甲蟲(chóng)LdFTZ-F1基因的克隆、序列分析及時(shí)空表達(dá)
　　搜索馬鈴薯甲蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到兩條LdFTZ-F1片段，RT-PCR驗(yàn)證其正確性后，通過(guò)RACE克隆，得到兩個(gè)LdFTZ-

4、F1變體:LdFTZ-F1-1和LdFTZ-F1-2。LdFTZ-F1是核受體型轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，可知LdFTZ-F1具有典型的結(jié)構(gòu)域:N端（A/B域）、DNA結(jié)合域（C域）、鉸鏈區(qū)（D域）和配體結(jié)合域（E域）。通過(guò)進(jìn)化分析可知，LdFTZ-F1與其它鞘翅目FTZ-F1聚于一支。分析LdFTZ-F1-1和LdFTZ-F1-2在各個(gè)齡期和不同組織中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在所有齡期和組織中均有表達(dá)。LdFTZ-F1-1在卵和三齡幼蟲(chóng)中高表達(dá)，

5、而LdFTZ-F1-2在最后一齡期、漫游期和成蟲(chóng)期表達(dá)量較高。在一齡和二齡，兩個(gè)變體的表達(dá)量都較低，二者可能具有不同的功能。兩變體在各組織中的表達(dá)相似，均是在腦-心側(cè)體-咽側(cè)體復(fù)合體和表皮中高表達(dá)。
　　2、分析20E、JH、ILP信號(hào)途徑對(duì)LdFTZ-F1表達(dá)的調(diào)控
　　對(duì)幼蟲(chóng)期不同日齡表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，LdFTZ-F1與蛻皮激素合成重要基因LdSHD的表達(dá)譜相似;RNAi沉默LdSHD后，20E滴度降低，同時(shí)LdFTZ-F1

6、的表達(dá)量也顯著下降。沉默LdILP2后， LdFTZ-F1的表達(dá)量極低，而用JH或JH類似物吡丙醚處理四齡初幼蟲(chóng)，或沉默LdAS-C和LdJHAMT，與對(duì)照相比，LdFTZ-F1的表達(dá)并不受影響。以上結(jié)果表明:20E和ILP信號(hào)通路參與調(diào)控LdFTZ-F1的表達(dá)，而JH信號(hào)途徑不參與這一過(guò)程。
　　3、沉默LdFTZ-F1基因的影響
　　連續(xù)三天用涂有dsLdFTZ-F1菌液的馬鈴薯葉片飼喂四齡初幼蟲(chóng)，觀測(cè)對(duì)其發(fā)育的影響。結(jié)

7、果顯示，試蟲(chóng)化蛹率極低，并最終死亡。qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，LdFTZ-F1的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而同時(shí)飼喂Hal的試蟲(chóng)其化蛹率和靶標(biāo)基因的表達(dá)均未得到回補(bǔ)。沉默LdFTZ-F1后檢測(cè)到蛻皮激素合成過(guò)程中的重要基因LdPHM、LdDIB、LdSHD的表達(dá)量顯著下降，導(dǎo)致20E的滴度也顯著降低。同時(shí)，20E受體LdEcR-A和LdEcR-B、LdUSP的mRNA降低，20E信號(hào)通路紊亂。保幼激素信號(hào)通路也受影響:JH的合成途徑被激活，JH滴度升