白背飛虱和灰飛虱蛻皮激素合成相關Halloween基因的克隆與功能驗證.pdf

1、蛻皮激素控制昆蟲發(fā)育、繁殖等過程。蛻皮激素從膽固醇而生物合成。幾個不同的由Halloween基因編碼的細胞色素P450單加氧酶催化關鍵步驟。但蛻皮激素合成過程中涉及到的相關P450酶只在有限的幾種昆蟲中得到驗證。RNA干擾(RNAi)技術可以通過沉默靶標基因而研究基因的功能。因此，導入dsRNA干擾昆蟲體內內源基因的表達，進而研究此基因功能的方法在昆蟲中得到廣泛應用。
　　本文搜索了重要的水稻害蟲——灰飛虱和白背飛虱的轉錄組中蛻皮

2、激素生物合成過程中相關的五個Halloween基因，采用RT-PCR、RACE技術獲得了Halloween基因的cDNA全長;利用飼喂dsRNA的方法研究了Halloween基因被干擾后分別對灰飛虱和白背飛虱的生物學效應。研究結果總結如下。
　　1.白背飛虱和灰飛虱蛻皮激素合成過程中相關Halloween基因的克隆
　　通過RT-PCR和RACE技術，分別獲得了白背飛虱和灰飛虱的5個Halloween基因的全長cDNA序列，

3、并命名為SfCYP306A1、LsCYP306A1、SfCYP302A1、LsCYP302A1、SfCYP314A1、LsCYP314A1、SfCYP315A1、LsCYP315A1、SfCYP307A1和LsCYP307A1。其中SfCYP306A、LsCYP306A、SfCYP302A1、LsCYP302A1、SfCYP314A1、LsCYP314A1和LsCYP315A1有五個保守的P450區(qū)域，即WxxxR(Helix-C)、G

4、xE/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFxPE/DRF(PERF motif)和血紅素結合區(qū)域PFxxGxRxCxG/A。而白背飛虱的CYP315A1僅獲得部分序列，丟失了兩個C端的保守區(qū)域，即PERF區(qū)域和血紅素結合區(qū)域。SfCYP307A1和LsCYP307A1基因序列中，Helix-C和Helix-I并不是保守的，但是在昆蟲中這些假定區(qū)域的序列非常相似。系統(tǒng)進化樹分析將其分為CYP2分支和線粒體分支

5、。前者包括CYP307A和CYP306A亞支，后者包括CYP315A1、CYP302A1和CYP314A亞支。
　　2.白背飛虱和灰飛虱蛻皮激素合成過程中相關Halloween基因的表達動態(tài)
　　分別測定了白背飛虱和灰飛虱的5個Halloween基因分別在4齡和5齡初期的表達量。在白背飛虱中，它們在四齡若蟲的第一天和五齡若蟲第一天都高表達，在四齡若蟲的第二天和第三天，Halloween基因的表達水平急劇下降。在灰飛虱中，這5

6、個Halloween基因在四齡若蟲的第二天和第五天存在兩個表達高峰，四齡若蟲第一天和五齡若蟲第一天存在兩個表達低谷。因此可以推斷，白背飛虱和灰飛虱Halloween基因時相表達模式與血淋巴中蛻皮激素的滴度一致。
　　3.RNAi介導的Halloween基因功能驗證
　　以喂食dsRNA的方法對白背飛虱二齡若蟲和灰飛虱四齡若蟲進行RNAi實驗，dsRNA濃度為0.5mg/ml，并連續(xù)喂食6和5天。qRT-PCR結果顯示，與空白

7、對照相比，灰飛虱和白背飛虱相應的Halloween基因和蛻皮激素受體基因(EcR)在mRNA表達水平均顯著下降。RNAi引起若蟲死亡并延緩若蟲的發(fā)育;對白背飛虱和灰飛虱試蟲cyp307a1基因進行dsRNA干擾后，微量點滴20-羥基蛻皮酮進行補償實驗。結果顯示，Sfcyp307a1和Lscyp307a1的表達水平沒有提高，但是幾乎完全恢復SfEcR和LsEcR mRNA的表達水平，并能補償RNAi對若蟲存活和發(fā)育帶來的負面影響。因此，本