家蠶蛻皮激素受體和超氣門蛋白在絲腺中的表達特征及其相關功能研究.pdf

1、20-羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）是調節(jié)昆蟲發(fā)育過程的重要激素。蛻皮激素受體(Ecdysone receptor，EcR)和超氣門蛋白（Ultraspiracle，USP）組成的異源二聚體是昆蟲20E的靶標。20E通過該異源二聚體誘導下游靶標基因的表達并傳遞20E信號。本文通過實時定量PCR技術檢測了20E處理后體內和體外離體培養(yǎng)條件下EcR和USP基因在家蠶絲腺中的表達水平;分別克隆了家蠶蛻皮激素受體結構

2、域EcR-B1D和超氣門蛋白結構域USPD，并構建原核表達載體，通過轉化大腸桿菌BL21，獲得表達產(chǎn)物并進行了純化;采用等溫量熱滴定技術（ITC技術）檢測了蛻皮激素受體結構域蛋白EcR-B1D與蛻皮激素響應元件E75A-EcRE及其缺失突變體的結合反應。本研究主要內容包括：
　?、?0E處理后BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因在家蠶絲腺組織中的表達。20E處理后BmEcR-A、BmEc R-B1和Bm USP基因在家

3、蠶中、后部絲腺的表達相比對照組均有不同程度增加，表明20E能夠促進更多BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達。但中部絲腺和后部絲腺BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達趨勢并不相同。
　?、企w外培養(yǎng)絲腺組織在20E處理后BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達。離體培養(yǎng)絲腺組織經(jīng)20E處理后BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達相比于對照組均增加，并與體內實驗的結果基本

4、一致。在20E和JHⅢ共處理條件下，BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達均上調，且強于20E單獨處理組，這一現(xiàn)象在中部絲腺表現(xiàn)更為顯著，表明JHⅢ在一定條件下能增強EcR和USP的表達。
　　⑶蛻皮激素受體結構域BmEcR-B1D和超氣門蛋白結構域BmUSPD的原核表達。分別克隆得到家蠶蛋白結構域序列EcR-B1D和USPD。家蠶EcR-B1D長度為786bp，編碼261個氨基酸殘基，預測蛋白質分子量為29.66

5、 kDa，等電點約為5.23;家蠶USPD長度為798bp，編碼265個氨基酸，預測分子量為29.76kDa，等電點約為5.75。將BmEcR-B1D和BmUSPD克隆到表達載體pET-28a(+)上，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導成功進行蛋白質表達并純化。
　?、菳mEcR-B1 D與BmE75A-EcRE及其缺失突變體的結合反應。在體外條件下通過等溫滴定量熱技術(ITC)獲得了BmE

6、cR-B1D蛋白與BmE75A-EcRE及其缺失突變體相互作用的一系列熱力學參數(shù)包括親和力常數(shù)(K)、反應熱(△H)和熵(△S)。結果表明BmEcR-B1D蛋白能夠與BmE75A-EcRE進行結合，并發(fā)現(xiàn)了BmE75A-EcRE的核心保守區(qū)為TCTTC。本實驗通過分析20E誘導下體內和體外家蠶絲腺組織中BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達，發(fā)現(xiàn)20E均可上調上述三種基因的表達水平;通過原核表達BmEcR-B1D和BmU